Bugün öğrendim ki: Köpeklerin, ancak yakın zamanda bilimsel olarak doğrulanan altıncı bir duyuları var. Araştırmacılar, köpeklerin diğer memelilerin zayıf termal radyasyonunu, onları göremedikleri veya koklayamadıkları durumlarda bile, 1,5 metre uzaktan algılayabildiklerini keşfettiler.
Zayıf termal radyasyonu algılama yeteneği, temel olarak endotermik hayvanlarla beslenen bir hayvana değerli duyusal bilgiler aktarma potansiyeline sahiptir. Bu tür bir radyasyonu algılama yeteneği böceklerde (Siyah ateş böceği, Melanophila acuminata)21, sürüngenlerde (bazı yılan türleri: Crotalinae, Boidae)22 ve şu ana kadar bir memeli türünde, kanla zengin bir şekilde beslenen deri bölgelerini tespit edebilen ve böylece bir konak hayvana indikten sonra ısırmaya uygun olan ortak vampir yarasada (Desmodus rotundus)23 bilinmektedir.
Rinarium, köpeklerde duyusal yapı olarak en önemli adaydır. Termal fotonlar, gözdeki bir fotopigmente izomerleşmek için çok zayıftır11. Ayrıca, gözün sulu ve camsı cisimlerindeki su, termal radyasyonu etkili bir şekilde emer. Rinarium dışında, bir köpeğin yüzünün diğer tüm bölümleri yalıtkan tüylerle kaplıdır. Vampir yarasalardaki hassas bölge de burun bölgesindedir ve aynı zamanda yüzün diğer kısımlarından biraz daha soğuktur23.
Sıcak duruma tepki olarak önemli bir aktivasyon gösteren kortikal alan, sol parietal somatosensoriyel korteksin kaudal sınırında yer almaktadır6b,19,20. Bu alan, belirli, hedefe yönelik eylemleri (örneğin hedefleme) planlamak ve yönlendirmek için farklı duyusal bilgileri (örneğin görsel, somatosensoriyel, propriyosepsiyon) eşleştirme konusunda çok önemli bir rol oynuyor gibi görünmektedir24. Bu durum, ısı sinyalinin karmaşık bir çevresel uyarının parçası olarak algılandığını ve yönlendirilmiş, hedefe yönelik eylemlerin 'sinirsel planlamasını' tetiklediğini düşündürebilir. Isı duyusunun avcı davranışında bir rolü olduğunu varsayarsak, bu aynı zamanda çok duyulu girdinin hızlı bir entegrasyonuna ve ardından gelen motor çıktısına da işaret edebilir. Kortikal burun ucu temsil bölgesi sadece birkaç milimetre boyutunda olmasına rağmen, rostral suprasylvian oluğun sonundaki anlamlı sinirsel aktivasyonun konumu19,20 ve deneyin diğer duyusal sistemlerin aktivasyonunu önleyecek şekilde dikkatlice kontrol edilmesi gerçeği göz önüne alındığında, önemli bir aktivasyon gösteren kortikal bölgenin büyük olasılıkla burun bölgesini temsil ettiğini belirtebiliriz. Ayrıca, tespit edilen aktivasyonun konumu, işitsel ve koku alma kortikal alanlarından açıkça ayırt edilebilir. Anatomi ders kitaplarına göre – lezyon çalışmalarına dayanarak – birincil kortikal koku alma alanı piriform lob, ayrıca lateral koku alma girusu ve parahipokampal girusdur. Koku alma soğanından kaynaklanan koku alma lifleri, bu alana lateral koku alma yolu aracılığıyla ulaşır ve bu sırada talamusu baypas eder19. Bilinçli ve anestezi altındaki hayvanlarda köpeğin koku alma sistemini inceleyen bir fMRI çalışması, düşük ve yüksek koku konsantrasyonu için koku alma soğanı ve ön koku alma korteksi, piriform korteks, periamigdala ve entorhinal korteks dahil olmak üzere bilateral piriform loblarda aktivasyon buldu25, bir diğeri ise koku alma soğanı, periamigdala, entorhinal korteks ve ön singulat kortekste aktivasyon buldu26. Köpeğin birincil işitsel alanı büyük ölçüde temporal lobda yer alır ve kaudal ectosylvian ve sylvian girusları da içeren orta ectosylvian girus etrafında merkezlenmiştir6b,19. Sylvian girusunun dorsal ve rostral bölgeleri işitsel ilişkilendirme korteksinin bir parçasıdır6b. İşitsel bölgelerin işlevsel olarak lokalize edildiği iki fMRI çalışmasında, aşağıdaki alanların aktive olduğu bulunmuştur: (1) Psedosylvian fissür boyunca (ventral olarak temporal kutba doğru uzanan) Sylvian giruslar ve ectosylvian sulkus boyunca dorsal olarak suprasylvian sulkusa uzanan ectosylvian giruslar27; (2) sağ orta suprasylvian sulkus; sol orta ectosylvian sulkus; sağ kaudal ectosylvian girus; sol orta ectosylvian girus; sağ tectum mesencephali; sol tectum mesencephali28. Yukarıda belirtilen çalışmalar ve anatomik veriler, ısı uyarısının ne koku alma ne de işitsel sistemler tarafından tespit edilmediği gerçeğine işaret etmektedir. Kortikal aktivasyonun sol hemisferik yanlılığına ilişkin bulgumuz, bu varsayımı tamamlamakta ve daha fazla desteklemektedir. İncelenen çoğu omurgalıda, gıda ayrımı veya avlanma gibi beslenme tepkileri ağırlıklı olarak sol yarımküre tarafından işlenmiştir29,30,31,32,33, daha geniş incelemeler için bkz.34,35,36. Özellikle köpeklerde, bir dolambaçlı yol görevinde, sağ görsel hemifieldlarını (ağırlıklı olarak sol yarımküre tarafından işlenen) kullanma tercihi gösteren saldırı eğitimli köpeklerin, görevi çözmek için tercihen sol görsel hemifieldlarını kullananlara göre daha az zamana ihtiyaç duydukları bulunmuştur; bu, sol yarımkürenin av yakalama davranışındaki uzmanlaşmasıyla uyumludur37.
Hemisferik asimetri bulgularımız aynı zamanda serebral duygusal işlemenin Değerlik Modeli ile de uyumlu görünmektedir, çünkü bu hipoteze göre, gıda ile ilgili sinirsel tepkilerle uyumlu olan olumlu duygular veya yaklaşımla ilgili duygusal durumlar ağırlıklı olarak sol yarımkürede işlenmektedir29,38,39,40. Bu hemisferik lateralizasyona karşılık olarak, köpeklerde farklı duygusal uyarılara tepki olarak asimetrik davranışlar bulunmuştur. Örneğin, köpeklerin korkutucu durumlar ve fiziksel stres sırasında toplanan insan kokularını koklamak için sol burun deliklerini daha sık kullandıkları, bunun da bir sol yarımküre yanlılığına işaret ettiği bulunmuştur41. Bu lateralize davranışla ilgili ilginç bir hipotez, bu korkutucu heterospesifik kemosinyallerin, sol lateralize sinirsel aktiviteye yansıyan köpeklerin av sürüsünü tetiklediğidir40. Başka bir örnekte, Quaranta ve ark. (2007), köpeklerin olumlu uyarılarla (yani köpeğin sahibi) karşılaştıklarında kuyruklarını tercihen sağa (kontralateral, sol yarımküre kontrolü) salladıklarını, duygusal olarak olumsuz uyarılarla (yani baskın bir köpek) ise ters yönün tercih edildiğini bulmuşlardır42. Racca ve ark. (2012) çalışmasında da benzer sonuçlar bulunmuştur; burada dışavurumcu köpek yüzleri sunulan köpekler, olumlu yüz ifadelerine bakarken sağ bakış yanlılığı (sol yarımküre avantajı), olumsuz yüz ifadelerine bakarken ise sol bakış yanlılığı (sağ yarımküre avantajı) göstermişlerdir43. Köpeklerde türüne özgü seslendirmeleri işlemek için de bir sol yarımküre yanlılığı gösterilmiştir, ancak sesler korku dahil yoğun duyguları tetikledikçe durum değişmektedir44.
fMRI deneyinde, bir ısı kaynağının varlığı veya yokluğu tespit edilmeliydi ve zayıf termal radyasyon algılandığında beynin hangi kısmının aktive olduğunu inceledik. Davranışsal deneylerde, köpeklerin bir ısı kaynağının yerini belirlemesi gerekiyordu. Uyarı sunan cihazdan gelen toplam radyasyon her zaman aynıydı ve köpek, sıcak uyarının hangi tarafta sunulduğunu belirlemek zorundaydı. Sonuçlarımız, köpeklerin zayıf termal radyasyonu algılayabildiğini, duyusal bilgileri yönlendirilmiş davranış için kullanabildiğini ve somatosensoriyel sistemin bu tür radyasyon tarafından aktive edildiğini göstermektedir.
Termal radyasyonun köpek rinariumunda nasıl dönüştürüldüğü belirsizdir. Derisi ve altındaki doku kompakttır ve boşluklardan yoksundur. İnnervasyon, dermiste çok sayıda büyük, yoğun miyelinli aksonlardan oluşur; bunlar epidermis içine, derinin yüzeyine yakın, dermis dokusunun çok sayıda çivi veya papillasında yükselir6c,45. Buna karşılık, crotaline yılanlarının çukur organları (örn.13,46,47) ve "basit" termal kameralardaki mikrobolometreler48, gelen termal radyasyonla kolayca ısınan ince, hafif bir yapı özelliğini paylaşır.
Deneylerimizin amacı, genel olarak köpeklerin yeteneklerini test etmekti. Çeşitli ortam sıcaklıklarında, çeşitli rinarium sıcaklıklarında, farklı uyarı boyutları, mesafeleri ve sıcaklıkları için eşikleri belirlemek daha fazla çalışma gerektirir. Bu araştırmada, çeşitli ırklardan ve boyutlardan köpeklerin yanı sıra iki farklı deneysel yaklaşım kullandık ve zayıf termal radyasyonu algılamanın Canis familiaris türünün yetenekleri dahilinde olduğunu bulduk. Bu yeteneğin sınırları ve mekanizmaları henüz aydınlatılmamıştır.
Genel konular
Rinarium, uyarıcı ve ortam sıcaklıklarını belirlemek için çalışmalarımızda doğru sıcaklık ölçümleri esastı. 18.0 mm (E30) veya 24.6 mm (T640) lens ile donatılmış bir FLIR E30 veya FLIR T640 termografik kamera (FLIR Systems, Wilsonville, ABD) kullandık. Davranışsal deneyde, FLIR E30 kamera köpeklerin rinariumlarını ve uyarıcılarını ölçmek için kullanılırken, FLIR T640 kamera deneysel oturumları kaydetmek için kullanıldı. fMRI deneyinde, FLIR T640 kamera köpeklerin rinariumlarını ve uyarıcılarını ölçmek için kullanıldı. Ölçümler 0.5 ila 1.0 m mesafeden yapıldı. Termograflardan gelen sıcaklık değerleri FLIR E30 kamera durumunda ekrandan okunurken, FLIR T640 kamera tarafından alınanlar FLIR Tools Plus yazılımı (FLIR Systems) ile değerlendirildi. İkinci durumda, sıcaklıklar rinarium üzerinde manuel olarak seçilen bir alandaki piksel değerlerinin ortalaması olarak belirlendi (bkz. 4,5).
Sıcak ve soğuk göreceli terimlerdir ve bu nedenle bazı tanımlar gereklidir. Çalışmamızda sıcak, ortam sıcaklığından daha sıcak anlamına gelir, böylece bir sıcaklık kontrastı oluşur. Soğuk uyarıcıya nötr diyoruz çünkü sıcaklığı ortam sıcaklığına mümkün olduğunca yakındı (termonetr, 13), yani bu tür bir kontrast yoktu veya çok azdı.
Deneylerimizde kullanılan tüm yayılan ısı uyarıcıları, çok kısa mesafelerde bile insan elleri tarafından hissedilemeyecek kadar zayıftı. Sıcaklığı hissetmek için yüzeylere dokunmamız gerekiyordu.
Davranışsal deney
Denekler
Kullanılan köpekler mesatisefalikti ve deneyler dışında eğitimsizdi. Özel sahipli evcil hayvanlardı ve ekonomik tazminat olmaksızın kullanımımıza sunuldular. Sahipler deneylerin doğası hakkında bilgilendirildi, olası alerjiler veya diğer gıda uyumsuzlukları hakkında sorular soruldu ve köpeklerinin çalışmada kullanılması için bilgilendirilmiş onamları alındı. Eğitimde sadece olumlu pekiştirme kullandık, köpekleri yiyecek (Frolic, Mars Inc., McLean, ABD) ve övgü ile ödüllendirdik. Tüm hayvanlar sağlıklıydı ve deneyler süresince sağlıklı kaldılar. Farklı boyutlarda üç yetişkin köpek kullandık (9, 18, 40 kg) (Tablo S1).
Etik beyanı
Deneyler Malmö/Lund etik komitesi tarafından onaylandı (izin M 148-12). Tüm deneyler ilgili kılavuzlara ve düzenlemelere uygun olarak gerçekleştirildi. İsveç, omurgalı hayvanları içeren araştırmalar için AB kurallarını 2013 yılında kabul etti ve bu düzenlemeler altında köpeklerle yaptığımız çalışma, evcil hayvanların normal kullanımı ve gözlemi olarak kabul edilmektedir.
Deneysel kurulum
Eğitim ve test, Lund Üniversitesi Biyoloji Binası'ndaki 2.3 × 3.4 m'lik, sıcaklık kontrollü bir odada gerçekleştirildi. Ortam sıcaklığı (18.8–19.3 °C) dijital bir termometre (EN 13485, TFA Dostmann, Wertheim, Almanya) ile izlendi. Köpeğin rinariumunun sıcaklığı her oturumdan önce, sırasında ve sonra termografik bir kamera (FLIR E30) ile ölçüldü. Biyolojik doku yüksek termal yayıcılığa sahiptir (yaklaşık 0.98, örn. 49) ve ortam sıcaklığı derinin sıcaklığına yakındı, bu nedenle yansıyan sıcaklığın önemi düşüktü. Kameranın yayıcılık ayarı bu nedenle 1.0'da tutuldu çünkü olası hata minimumdu (maks. 0.1 °C) ve bu ayarla kamera uyarıcının yayılan sıcaklığını ölçmek ve kontrol etmek için de kullanılabilirdi.
Oda, uzun kenarları koyu kontrplak levhalarla ve bir kısa kenarı stor perdeli ahşap bir çerçeve ile sınırlandırılmış deneysel bir arenayı içeriyordu. 15 W'lık bir fan (Faset, Rusta, Upplands Väsby, İsveç) çerçevenin tepesinden 45° aşağıya ve uyarıcıların sunulduğu arenanın diğer kısa kenarına doğru üflüyordu. Köpek bir sonraki deneme için arenanın dışında beklerken, perde kapalıydı, bu da köpeğin arenaya girmesini ve bir sonraki denemenin nasıl kurulduğunu görmesini engelliyordu (Şekil S2). Uyarıcı yüzeylerinden ölçülen 1.6 m uzunluğundaki kontrplak bir ayırıcı, sol ve sağ uyarıcıları ayırıyordu. Ayırıcının ucu ile perde arasında 0.4 m daha vardı. Kurulumda kullanılan malzemeler her iki tarafta da aynı tip ve yaştaydı.
Termal uyarıcılar
Uyarıcılar, 300 × 320 mm yüzey alanına sahip iki adet 42 mm kalınlığında panel ile üretildi (Şekil S1). Her panelin bir yüzü, panelin iç kısmında düşük voltajlı bir DC ile çalışan bir ısıtma kablosu taşıyan 6 mm'lik bir alüminyum plakadan oluşuyordu. Alüminyum plaka, ahşap bir sapla donatılmış sert ahşap bir çerçeve ile 12 mm kontrplaktan oluşan diğer tarafa bağlandı. Çerçeve, soğuk yüzeyi sıcak olandan yalıtmak için 24 mm genişletilmiş polistiren köpük ile dolduruldu. Her iki dış yüzey (alüminyum ve kontrplak) yüksek termal yayıcılığa sahip mat siyah yapışkan plastik folyo (d-c-fix, Konrad Hornschuch, Weissbach, Almanya) ile kaplandı. Sürüş voltajı, sıcak yüzeyin yayılan sıcaklığının ortam sıcaklığının yaklaşık 11–13 °C üzerinde (31 ± 1 °C) olacak şekilde ayarlandı, böylece uyarıcı bir avcı için ilgili termal radyasyon kaynaklarıyla yaklaşık olarak eşleşti (örn. 47). Yalıtıma rağmen, biraz ısı, ortam sıcaklığından 1–2 °C daha sıcak olan soğuk yüzeye (nötr uyarıcı) sızdı. Voltaj, çalışma sıcaklığına ulaşmak için bir oturumdan en az 30 dakika önce her iki panel için açıldı ve termal hareketlerin neden olduğu akustik ipuçlarından kaçınmak için oturum sırasında açık tutuldu. Fan açıldı ve aynı anda açık tutuldu.
Paneller kayar çekmece bağlantılarına yerleştirildi ve mıknatıslarla tutuldu (Şekil S2). Her panel, sıcak yüzeyi sunum cihazının bir tarafında ve diğer tarafında köpeğe nötr yüzeyi sunmak için kaydırıcısı üzerinde 180 derece döndürülebilirdi (Şekil S2), bu da sunum cihazının her iki tarafında her zaman sıcak ve nötr bir panel yüzeyi olduğu anlamına geliyordu. Bekleyen köpeğe herhangi bir akustik veya zamanlama ipucu vermemek için, paneller döndürülmeseler bile her seferinde kaydırıcılardan kaldırıldı ve geri konuldu. Her iki panelin altında, herhangi bir termal radyasyondan korunmuş, aynı miktarda ve türde yiyecek içeren kaseler vardı. Termal kamera ile yapılan ölçümler, yiyeceğin uzun süreli çalışmada bile ortam sıcaklığında kaldığını doğruladı. Nötr uyarıcı tarafında, kaydırma mekanizması, köpek tarafından görünmez bir şekilde kilitlendi, böylece yiyecek ödülü erişilemez hale geldi. Sıcak uyarıcı tarafında, köpek yiyeceğe erişmek için kaydırıcıyı geriye doğru itebiliyordu; başlangıç eğitiminde yüzeye rinariumu ile dokunuyordu, böylece sıcak uyarıcı ve yiyecek ödülü sezgisel olarak bağlandı. Taraflar arasındaki eşitsizliklerden, aynı tip ve yaştaki malzemeler, aynı tip ve miktarda yiyecek, aynı, kapalı kaydırıcı konumları ve fanın köpeğin konumundan sunum cihazına doğru üflemesi kullanılarak mümkün olduğunca kaçınıldı. Bu, köpeklerin termal radyasyon uyarıcılarını ilgili uyarıcılar olarak tanımlamasını kolaylaştırmayı amaçlıyordu. Kurulumdaki iki taraf arasındaki kalan eşitsizlikler, köpeklerin doğru seçimler yapmasına yardımcı olamazdı çünkü hayvanlar eşit sıklıkla sol veya sağ tarafı seçmek zorundaydı, hiçbir şey fiziksel olarak soldan sağa veya tam tersi hareket ettirilmiyordu. Uyarıcılar, art arda en fazla üç eşit seçimin olduğu bilgisayar tarafından oluşturulan sözde rastgele listeler izlenerek sunuldu50. Daha uzun eşit seçim serileri, hayvanın yan tercihlerine yol açabilir ve bu da deneyleri tehlikeye atar. Panellerin merkezleri 460 mm aralıktaydı (= ayırıcının ön kenarından 16 derece).
Deneysel prosedür
Eğitimdeki ilk adımlar, köpeğe kaydırıcıların çalışmasını öğretmek ve sıcak tarafta erişilebilir bir yiyecek ödülü olduğunu fark etmesini sağlamaktı. Deneyci, yayılan vücut ısısı 1.4 m yüksekliğe kadar kontrplakla korunarak kaydırıcıların arkasında duruyordu (Şekil S2). Bu konumdan, deneyci stor perdeyi açtı ve köpeği arenaya çağırdı. Başlangıçta, sıcak uyarıcılı kaydırıcı kısmen açıldı, böylece yiyecek ödülü köpek arenaya girer girmez görünür hale geldi. Ayrıca, deneyci sıcak tarafı işaret etti. Köpek temel prosedürü öğrendiğinde, sıcak uyarıcıyı görüntüleyen kaydırıcı da perde açıldığında kapandı ve deneyci, yardım teklif edilmeden önce köpeğin duyusal bilgi toplamasına izin vermek için küçük bir gecikmeyle sıcak tarafı işaret etti. İşaretleme, giren köpeğin odağı deneyciden panellere kaydığında sonlandırıldı. Köpeğin başı ayırıcının ön kenarını geçer geçmez bir seçim doğru veya yanlış olarak kaydedildi. Köpekler görevi öğrenirken yardım aldıkları için anlamlı öğrenme eğrileri elde edilmedi.
Köpek yardım almadan eğitim denemelerinin %70'inde tutarlı bir şekilde doğru seçim yaptığında, uyarıcı boyutu, köpeğe bakan her iki panel yüzeyine takılan kapaklarla azaltıldı. Kapaklar, 5 mm Masonite üzerine lamine edilmiş 10 mm genişletilmiş polistiren köpükten oluşuyordu ve siyaha boyanmıştı. Her kapak, panel yüzeyinden gelen radyasyonun köpeğe ulaşmasını sağlayan 102 mm çapındaki merkezi bir delik dışında, köpeğe bakan tüm panel yüzeyini gizledi. Panel yüzeyi ile kapağın arkası arasındaki yaklaşık 10 mm'lik boş alan, panelin aşırı ısınmasını önlemek için sıcak yüzeyde havanın rahatsız edilmeden konveksiyonuna izin verdi. Kapaklar uyarıcıyı 3.7 derecelik bir katı açıya düşürdü. Üç kapak mevcuttu, böylece sıcak panel yüzeyinde kullanılan kapak, sürekli kullanımdan kaynaklanan gözle görülür ısınmayı önlemek için tekrar kullanılmadan önce soğuyabilirdi. Üç kapağın dönüşümlü kullanımı, köpeğin sıcak tarafı iterken bıraktığı burun izlerinden kaynaklanan anlamlı ipuçlarını da önledi.
Bu koşullar altında, aşağıdaki durumlarda işaretleme geçici olarak (birkaç oturum için) yeniden başlatıldı: kapakların tanıtılmasından sonra, uzun süreli deneysel hareketsizlik dönemlerinden sonra (örn. yaz tatili) veya köpek sadece deneyciye odaklanırsa. Veri toplama için, her oturumda en fazla 15 deneme yaptık, böylece köpek tüm deney boyunca uyanık kalabildi. Her köpek için bireysel olarak önceden tanımlanmış bir durdurma kriteri vardı (Kevin: arka arkaya iki kez seçim yapmak için 13 saniyeden uzun süreye ihtiyaç duydu; Delfi: rinarium sıcaklığı 21.5 °C'yi aştı; Charlie: 13 saniyeden uzun süreye ihtiyaç duydu). Veri toplama oturumları en az beş deneme uzunluğundaydı ve çift kör olarak gerçekleştirildi. Deneyci, ikinci bir kişi denemeyi kurarken odadan çıktı. Deneyci odaya girdi ve her zamanki konumunu aldı, perdeyi açtı ve doğru cevabı bilmeden köpeği arenaya çağırdı. Köpeğin rutindeki değişikliği kabul etmesi ve öğrenme kriterine tekrar ulaşması için birkaç eğitim oturumu gerekliydi.
Çift kör test, sadece rinarium cilt yüzeyi sıcaklıkları 21.5 °C (M = 18.9, SD = 0.6) veya daha düşük olduğunda gerçekleşti. Bu, 19 °C ortam sıcaklığında uyanık ve tetikte köpeklerde gözlenen rinarium sıcaklıklarının üst sınırıdır ve uyuyan köpeklerinkinden önemli ölçüde düşüktür5. Köpeklerin işbirliği yapmaya hazır olduğundan emin olmak istedik ve bu nedenle yukarıda belirtilen sınırın üzerindeki sıcaklıklara ısınma meydana gelirse test oturumlarına son verildi. Her veri toplama oturumu en az beş denemeden oluşuyordu. Her köpekle yapılan toplam test oturumu sayısı, köpeğe erişimimize, motivasyonuna ve rinarium sıcaklık dinamiklerine bağlıydı.
İstatistiksel analiz
Çift kör denemelerden elde edilen sonuçlar, köpeklerin performanslarının şans seviyesinden farklı olup olmadığını belirlemek için tek kuyruklu kümülatif binom dağılımı ile karşılaştırıldı. İstatistiksel testler R Core Team, 2016 kullanılarak yapıldı.
fMRI deneyi
Denekler
Sahipleriyle birlikte yaşayan on üç evcil köpek test edildi (5 golden retriever, 4 border collie, 1 Avustralya çoban köpeği ve 1 Çin tepeli köpek ve 2 karışık ırk; yaşları 1.5–10 yıl (ortalama = 6.83, SD = 1.83); 5 dişi ve 8 erkek) (Tablo S1). Köpeklerin sahipleri, köpekleriyle birlikte eğitim ve test prosedürüne katılmaya gönüllü oldular, yazılı bilgilendirilmiş onam verdiler ve hiçbir parasal tazminat almadılar.
Etik beyanı
Deneysel prosedürler, hayvan bakımıyla ilgili ulusal ve Avrupa kılavuzlarını karşıladı ve yerel etik komite tarafından onaylandı (Állatkísérleti Tudományos Etikai Tanács KA-1719, Budapeşte, Macaristan; Pest Megyei Kormányhivatal Élelmiszerlánc-Biztonsági és Állategészségügyi Igazgatósága XIV-I-001/520-4/2012, Budapeşte, Macaristan).
Deneysel kurulum
fMRI deneyleri Budapeşte, Macaristan'daki Semmelweis Üniversitesi MR Araştırma Merkezi'nde gerçekleştirildi. Köpekler deneyler sırasında uyanıktı ve MR tarayıcısında düz ve hareketsiz yatmaları için eğitildiler. Köpekleri uyanık fMRI deneylerine hazırlayan eğitim prosedürü (Márta Gácsi tarafından geliştirilmiştir27), olumlu pekiştirme ve sosyal öğrenmeye dayanıyordu. Köpekler hiçbir şekilde kısıtlanmadı ve tarayıcıyı istedikleri zaman terk edebildiler.
MR tarayıcısının odasının bitişiğinde, bilgisayarları barındıran ve köpeklerin ve diğer tüm insan katılımcıların (köpek sahibi, operatör: tarayıcıyı kontrol eden, deneyci: uyarıcı sunumunu kontrol eden, eğitmen: köpeğin MR eğitmeni) deneysel koşular arasında bekleyebileceği bir alan sağlayan işletme ve bekleme odası bulunuyordu.
Tarama odasının ortam sıcaklığı bir termostat tarafından ayarlandı ve ortalama 22.5 °C (SD = 1.25 °C) idi. Sıcak uyarıcı, ortam sıcaklığından ortalama 10.7 °C (SD = 0.95 °C) daha sıcaktı.
Köpekleri çalışmanın özel koşullarına (örn. tarayıcıda bulunan insanlar, çalışmada kullanılan cihaz) hazırlamak için, köpekler tarayıcının bekleme odasında ve tarayıcıda ölçümlerden önce 5–10 dakikalık ön koşullanmalar aldılar. Deney, ön koşullanma aşamasından yaklaşık 5 dakika sonra başladı (deneysel prosedürün ayrıntıları için bkz. Ek Materyaller/fMRI Deneysel prosedür).
Termal uyarıcılar
Deneyde, bir 'uyarıcı sunan' cihaz tarafından sunulan iki tip uyarıcı kullanıldı (Şekil S3). Köpeklerin burnunun 240 mm önünde sunulan 60 × 100 mm'lik sıcak bir yüzey ve 60 × 100 mm'lik nötr (ortam sıcaklığında) bir yüzey, her ikisi de aynı şekilde siyah. Bu mesafeye, köpeğin burnunu 'uyarıcı sunan' cihazın altına takılan bir kağıt cetvelin ucuna konumlandırması sağlanarak ulaşıldı (Şekil S3).
Deney sırasında, 'uyarıcı sunan' cihaz tarayıcının içinde köpeğin önündeydi ve deneyci tarafından çalıştırılıyordu. Cihaz, 20 mm kalınlığında genişletilmiş polistiren köpük katmanlarıyla çevrili 530 × 160 × 110 mm'lik ahşap çerçeveli bir kutuydu. Yalıtım katmanlarının içinde, sıcak (ortam sıcaklığına ayarlanmış) su ile dolu 60 × 100 × 400 mm'lik cam bir küboid vardı. Cam küboidin 60 × 100 mm'lik bir yüzeyi siyah elektrik bandı ile kaplandı ve sıcak uyarıcı olarak görev yaptı (Şekil S3). Siyah elektrik bandının yüksek yayıcılık değeri, onu yüzey malzemesi olarak uygun hale getirdi. Cihaz, köpeğe bakan uçta iki kapı ile donatılmıştı. Kapılar, cihazın diğer ucundaki iplerle deneyci tarafından çalıştırılıyordu. Dış kapı (köpeğin burnuna daha yakın olan), her denemede uyarıcıları sundu, açıldığında sıcak veya nötr uyarıcıyı görünür kıldı. İç kapı (köpeğin burnundan daha uzak olan), 20 mm kalınlığında genişletilmiş polistiren köpük tabakasıyla yalıtılmıştı ve doğrudan cam küboidin önünde bulunuyordu (Şekil S3). Denemeler arasında sıcak ve nötr uyarıcılar arasında geçiş yapmak için kullanıldı. Deneyci, onu kapatarak veya açık bırakarak, dış kapıyı açtığında sıcak yüzeyi ya örtebilir (nötr uyarıcı) ya da açık bırakabilirdi (sıcak uyarıcı). Köpekler bu kapının hareketini göremiyordu, çünkü sadece dış kapı kapalıyken denemeler arasında hareket ettiriliyordu. Önemli bir nokta, iç kapının köpeğe ve sıcak uyarıcıya bakan yüzeyinin aynı siyah elektrik bandı ile kaplanmış olmasıydı, bu yüzden sıcak ve nötr uyarıcılar esasen aynı görsel görünümlere sahipti.
Deneysel prosedür
Deney, 3 adet 5.5 dakika süren koşudan oluşuyordu. Ardışık koşular arasında en az 10–15 dakika süren molalar verildi.
İki uyarıcıya göre, blok tasarımında sunulan sıcak ve nötr olmak üzere iki koşul vardı. Uyarıcı bloklarının sunumu ölçümle eş zamanlı olarak başladı. Bloklar, aralarında kısa bir mola (dış kapının kapanması ve açılması) olan 2 × 2 saniyelik uyarıcı gösterimlerinden oluşuyordu. Uyarıcıların aralıklı sunumu, doğal olarak oluşan sıcak uyarıcıların muhtemelen dalgalanan algılanabilirliğini temsil ediyordu. Bir koşuda toplam 14 blok vardı ve sıcak ve nötr koşulların sayıları eşitti. Bloklar yarı rastgele bir sırada birbirini takip etti (aynı tarafta arka arkaya ikiden fazla deneme yok; ilk iki deneme farklı taraflarda), 3 koşunun her birinde farklıydı (3 farklı rastgeleleştirme: rnd1, rnd2, rnd3). Bloklar değişen uzunluktaki temel dönemlerle (7–10 saniye, ortalama: 8.5 saniye) ayrıldı. Köpeklerin 3 koşuya katılım sırası, 13 denek için mümkün olduğunca dengelendi (2 köpek/5 permütasyon, 3 köpek/1 permütasyon). (Veri toplama ayrıntıları için bkz. Ek Materyaller/fMRI deneyi-Veri toplama).
Veri analizi
Görüntülerin ön işlenmesi ve analizleri için MATLAB R2016b (http://www.mathworks.com/products/matlab/) ve SPM12 (http://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm)51 kullandık. Ön işleme aşağıdaki adımlardan oluşuyordu. Fonksiyonel EPI-BOLD görüntüleri önce yeniden hizalandı. Köpek başına maksimum hareket ortalaması, çeviri yönleri için 1.5 mm'nin ve rotasyon yönleri için 0.01 radyanın altındaydı. Köpeklerin anatomik görüntüleri daha sonra, Thermo Scientific Amira for LifeSciences 6.0 yazılım platformu (https://www.thermofisher.com/us/en/home/industrial/electron-microscopy/electron-microscopy-instruments-workflow-solutions/3d-visualization-analysis-software/amira-life-sciences-biomedical.html) kullanılarak seçilen bir şablon (golden retriever, erkek, 7.5 yaş) ile ortak bir alana dönüştürüldü. Ortalama fonksiyonel görüntü, artık normalleştirilmiş anatomik görüntüye Amira yazılımı kullanılarak kaydedildi ve normalleştirilmiş bir ortalama fonksiyonel görüntü elde edildi. Ortalama fonksiyonel görüntü ile normalleştirilmiş ortalama fonksiyonel görüntü arasındaki dönüşüm matrisi, SPM'nin 16 iterasyonlu standart doğrusal olmayan çarpıtma fonksiyonu ile tahmin edildi ve boşluk, insanlarda kullanılan MNI koordinat sistemine benzer şekilde, orijin olarak commissura rostralis etrafında merkezlendi52,53. Ortaya çıkan dönüşüm matrisi daha sonra tüm yeniden hizalanmış fonksiyonel görüntülere uygulandı. Son olarak, uzamsal filtreleme için, normalleştirilmiş fonksiyoneller izotropik bir 3-D Gauss çekirdeği (FWHM = 4 mm) ile evriştirildi.
fMRI verilerinin analizi, genel bir lineer model ve istatistiksel parametrik haritalama kullanılarak gerçekleştirildi. Her koşu ve her iki blok tipi için koşul regresörleriyle bir model oluşturuldu: sıcak ve nötr. Koşullar 2 saniye süren bloklar olarak modellendi. Olası hareket artefaktlarını modellemek için her koşu için yeniden hizalama regresörleri de dahil edildi. Düşük frekanslı sinyalleri kaldırmak için 128 saniyelik döngü kesme değerine sahip yüksek geçişli bir filtre kullanıldı. Regresörler, SPM'nin kanonik hemodinamik tepki fonksiyonu ile evriştirildi. Tek denekli sabit etki analizlerimizde bir t-kontrastı test ettik: sıcak vs. nötr uyarıcı (W > N). Grup düzeyinde, bireysel denekler için oluşturulan kontrast görüntüleri, tek örnekli rastgele etkiler analiz modeline dahil edildi. p < 0.001'lik genel bir voksel eşiği uygulandı ve yalnızca çoklu karşılaştırmalar için FWE düzeltmeli (küme düzeyinde) kümeler anlamlı etkiler olarak kabul edildi (p < 0.05).
Hemisferik lateralizasyon etkilerini değerlendirmek için, tepe vokseli (x = −12, y = −14, z = 18, r = 4 mm)52 çevresinde gözlenen sıcak > nötr kontrastının yüzde sinyal değişimini ve sağ yarımküredeki karşılığını (x = 12, y = −14, z = 18, r = 4 mm)52 bir Mann-Whitney-U testinde karşılaştırdık. Ortalama parametre tahminleri, girdi olarak denek spesifik beta görüntüleri kullanılarak bu hacim içinde hesaplandı. Yüzde sinyal değişimleri, seçilen kürenin ortalama beta değerlerine göre her denek için hesaplandı (araç kutusu: WFU_pickatlas 3.0.5 (http://fmri.wfubmc.edu/software/pickatlas). Tüm istatistiksel analizler IBM SPSS 22 (https://www.ibm.com/products/spss-statistics) kullanılarak gerçekleştirildi.