Bugün öğrendim ki: 19. yüzyıldaki çiçek hastalığı salgını sırasında Mi'kmaq şifacılarının hastaları tedavi etmek için mor sürahi bitkisinden elde edilen çayı kullandıkları ve İngiliz doktorların daha sonra bunun gerçekten işe yaradığını doğruladıkları biliniyor.
Giriş
1800'lerin sonlarında, Nova Scotia'daki Micmac Kızılderilileri çiçek hastalığı için bitki bazlı bir çözümün varlığını ilan ettiler. Bu dönemde, Kraliyet Topçusu Yardımcı Cerrahı Herbert Miles, çiçek hastalığı salgını sırasında “aralarında dolaşan ve vakaları (bitkisel) bir infüzyonla tedavi eden yaşlı bir kadın… her vakayı iyileştirmede o kadar başarılıydı” diye rapor etti. Bu bitkisel infüzyonun daha sonra etobur bitki Sarracenia purpurea'dan elde edildiği açıklandı [1], [2].
1892'de Charles Millspaugh, Kuzey Amerika'nın doğusundaki Yerli Amerikalılarının S. purpurea'yı çiçek hastalığına karşı lapa olarak kullandığını ve bunun “korkunç belaya karşı bilinen en büyük çareyi” sağladığını belirtti [3]. Kraliyet Atlı Muhafızları Baş Cerrahı C.G. Logie, alayındaki variola enfeksiyonlu erkekleri tedavi etti ve S. purpurea'nın “püstüllerin gelişimini durdurduğu, virüsü içeriden öldürdüğü, böylece hastalığın karakterini değiştirdiği ve çukurlaşma nedenini ortadan kaldırdığı” görüldü [4]. Bununla birlikte, S. purpurea'nın iddia edilen tıbbi özellikleri büyük ölçüde unutulmuştur.
İnsan gelişmesinden önce, Avcının Kupası, Eyerçiçeği veya Hint Sürahisi Bitkisi olarak da bilinen S. purpurea, Labrador'dan Florida'ya kadar Kuzey Amerika'nın Atlantik kıyı şeridi boyunca ve batıda Wisconsin ve Minnesota'ya kadar geniş bir alana yayılmıştı [13], [14]. S. purpurea, yaprakları kaplar oluşturan ve böcekleri yakalamak için suyla dolan etçil bir bataklık bitkisidir.
Çiçek hastalığı salgınları binlerce yıldır insan nüfusunda meydana gelmiştir, ancak başarılı bir dünya çapında aşılama programının ardından doğal hastalık artık yok edilmiş sayılmaktadır. Son yıllarda, variola virüsünün biyoterörizm aracı olarak kullanılabileceğine dair artan bir endişe vardır [30]. Ayrıca, ilgili maymun çiçeği virüsü insan nüfusu için ortaya çıkan bir tehdit oluşturmaktadır [19], [30]. Aşı, çiçek hastalığı virüsü enfeksiyonuna karşı etkili koruma sağlasa da, çiçek hastalığı aşısıyla ilişkili yan etkiler ve riskler oldukça yaygındır ve oldukça şiddetli olabilir [27], [30]. Orthopoxvirüs ile ilgili enfeksiyonların artan tehdidi, etkili çiçek hastalığı virüsü karşı önlemlerinin keşfedilmesi ihtiyacını vurgulamaktadır. Bu yazıda, S. purpurea'nın Orthopoxvirüs replikasyonunu etkili bir şekilde inhibe eden bir madde olarak ‘yeniden keşfini’ ve karakterizasyonunu sunuyoruz.
Yöntemler
Hücre hatları ve virüsler
Tavşan Böbreği (RK-13, Amerikan Tip Kültürü Koleksiyonu (ATCC) CCL-37) hücreleri, %5 fetal dana serumu (FBS) (HyClone) ile desteklenmiş Eagle'ın Minimal Esansiyel Ortamında (MEM) (Cellgro) tutuldu. HeLa (ATCC CCL-2) hücreleri, %5 FBS ile desteklenmiş Dulbecco'nun Modifiye Edilmiş Minimal Esansiyel Ortamında (DMEM) (Cellgro) tutuldu. Tüm hücreler, %10 CO2 varlığında 37°C'de inkübe edildi. Vaksinia virüsü (Kopenhag suşu), VACV olarak belirtildi ve Virogenetics tarafından sağlandı. Maymun çiçeği virüsü (Walter Reed 267 suşu), MPXV olarak belirtildi ve BEI Kaynakları tarafından sağlandı. Variola virüsü (BSH74 sol suşu), VARV olarak belirtildi ve Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezlerinde (Atlanta, GA) deneyler için sağlandı ve kullanıldı. 5. tip Adenovirüs (Adeno), veziküler stomatit virüsü, Indiana suşu (VSV), fare hepatit virüsü A59 (MHV), 3. tip reovirüs, Dearing suşu (Reo), ensefalomiyokardit virüsü (EMCV) Amerikan Tip Kültürü Koleksiyonundan (ATCC) elde edildi. MHV için, MHV A59 CEACAM (karsinoembriyonik antijen hücre adezyon molekülü izoformu 1a) reseptörünü ifade eden HeLa-MHVR hücreleri Tom Gallagher (Loyola Üniversitesi Tıp Merkezi, Maywood, IL) tarafından sağlandı.
Bitkisel özüt hazırlama
Bu çalışmada aşağıdaki şifalı bitkiler kullanıldı: Sarracenia purpurea, Astragalus membranaceus, Echinacea angustifolia ve Coriolus versicolor. S. purpurea özütü hazırlanması için, ABD'nin güneydoğusundaki bir serada yetiştirilen taze bütün bitkiler gece ekspres kargoyla gönderildi ve üretim tesisinde (Sedona, AZ) alındı. Bitkiler aynı gün elle temizlendi, bitkinin sürahi yapısının taban kısmının orman atıklarından arındırılmasına özel dikkat edildi. Temizlenmiş bütün bitki, %190'lık tahıl etanolü/damıtılmış su/sebze gliserin (63%/32%/5%) karışımı varlığında bir Hamilton Beach Paslanmaz çelik blender'da nazikçe öğütüldü. Bitki/sıvı karışımı, kehribar renkli bir cam kaba aktarıldı, sıkıca kapatıldı ve oda sıcaklığında 48 gün inkübe edildi. Sıvı, katı bitki maddesinden preslendi, ağartılmamış kağıt filtrelerden filtrelendi, havuzlandı ve kehribar renkli cam şişelere şişelendi. Her bir özütün bir örneği kurutuldu ve tüm özütlerin benzer konsantrasyonlarda uçucu olmayan çözücüler (62,4–136,8 mg/ml özüt arasında değişen) içerdiği bulundu.
Sidofovir tedavisi
Sidofovir (Sigma-Aldrich) tedavisi daha önce açıklandığı gibi yapıldı [15], [16].
VACV plak testi
RK-13 hücreleri 150 pfu VACV ile enfekte edildi. 15 mpi'de virüs uzaklaştırıldı ve ml başına 0, 1, 3, 10 ve 30 mikroL S. purpurea özütü hücre kültürü ortamına eklendi. Çoklu S. purpurea tedavisi alan hücreler için, ortam her altı saatte değişen miktarlarda S. purpurea özütü içeren taze ortamla değiştirildi. Hücreler, %5 CO2 varlığında 48 saat boyunca 37°C'de inkübe edildi. VACV plakları kristal viyole boyama ile görselleştirildi [23].
Tek döngülü büyüme kinetiği
RK-13 hücreleri 15 dakika boyunca 10 MOI'de VACV ile enfekte edildi, ortamla 2 kez yıkanıp ml başına 25 mikroL S. purpurea özütü/ortam ile tedavi edildi. Çoklu S. purpurea tedavisi alan hücreler için, ortam her altı saatte değişen miktarlarda S. purpurea özütü içeren taze ortamla değiştirildi. S. purpurea ile tedavi edilmeyen hücreler, ml başına 25 mikroL %63 etanol, %5 gliserol çözeltisi (etanol/gliserol taşıyıcı)/ortam ile tedavi edildi. Enfekte hücreler, ortamda kazıma ve 3 kez dondurma/çözülme yoluyla 2, 6, 12, 18 ve 24 hpi'de hasat edildi. Viral titreler plak testi ve RK-13 hücrelerinde kristal viyole boyama ile belirlendi.
Ortopoxvirüs protein sentezi ve CPE
HeLa hücreleri 15 dakika boyunca 10 MOI'de VACV ile enfekte edildi, ortamla 2 kez yıkanıp 0, 15, 30, 60 ve 120 mpi'de ml başına 25 mikroL S. purpurea özütü/ortam ile tedavi edildi. VACV kaynaklı CPE'yi kaydetmek için hücre monokülerleri 6 hpi'de fotoğraflandı. 3 ve 6 hpi'de hücre lizatları RIPA lizi ile hazırlandı [24]. Hücre lizatları, SDS-PAGE ile %12 poliakrilamid jellerde analiz edildi. Proteinler nitroselüloz membranlara transfer edildi, VACV-E3L proteinine veya toplam VACV proteinlerine yönelik antikorlarla inkübe edildi ve kemilüminesans ile tespit edildi (Pierce SuperSignal West Pico Kemilüminesans Substrat). E3L proteininin relatif seviyeleri ImageQuant yazılımı kullanılarak nicelendirildi. MPXV enfeksiyonları, bir BSL-3 tesisi kullanılarak ve 0 ve 15 mpi'de S. purpurea ile tedavi edilerek aynı koşullar altında yapıldı. VARV enfeksiyonları, benzer koşullar altında bir BSL-4 tesisi kullanılarak ve 0 mpi'de S. purpurea ile tedavi edilerek Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezlerinde (Atlanta, GA) yapıldı. Adeno, VSV, MHV ve Reo virüsleri ile enfeksiyonlar, 15 mpi'de S. purpurea tedavisi ile benzer şekilde yapıldı ve lizatlar 8 hpi'de hazırlandı. Adeno-E1, VSV-G, MHV-E ve Reo-çekirdek proteinlerine özgü antikorlar, viral protein sentezini ölçmek için kullanıldı. VACV'nin diğer bitkisel özütlerle (Echinacea, Astragalus, Coriolus ve Glycyrrhiza) tedavisi, 15 mpi'de ml başına 25 mikroL özüt/ortamda yapıldı ve hücre lizatları 6 hpi'de hazırlandı.
Hücre canlılığı
HeLa hücreleri belirtilen konsantrasyonlarda S. purpurea ile tedavi edildi. Canlılık, işlemden 6 saat sonra trypan mavisi dışlama ile belirlendi.
İmmünofloresans
Poli-l-lizin kaplı örtücü camlar üzerinde yetiştirilen subkonfluent HeLa hücreleri, siyan floresan proteini çekirdek A5 proteinine (B. Moss, NIH tarafından sağlandı) kaynaştırılan bir VACV yapısıyla 20 MOI'de enfekte edildi. Enfeksiyon 10 dakika boyunca 4°C veya oda sıcaklığında tutuldu, ortamla 2 kez yıkanıp S. purpurea özütü ile tedavi edildi. 1 saatlik işlemden sonra, hücreler PBS ile yıkanıp oda sıcaklığında 20 dakika boyunca %4 paraformaldehit ile fiks edildi. Hücreler, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS'de 50 mM amonyum asetat ile söndürüldü. Hücreler PBS ile yıkanıp oda sıcaklığında 15 dakika boyunca %0,2 Triton X-100 ile geçirgenleştirildi. Hücreler, 30 dakika boyunca GTP bloke edici tamponu (0,2% jelatin/0,1% Triton X-100/1XPBS) ile bloke edildi, ardından gece boyunca 1:500 seyreltmede 4°C'de eIF2-alfa antiserum (Cell Signaling) ile boyandı. İkincil antikorlar (Alexa Fluor 488- Invitrogen), oda sıcaklığında 1 saat boyunca GTP'de 1:500 oranında örtücü camlara uygulandı, ardından 3 kez GTP ile yıkandı. Örtücü camlar ProLong Gold antifade reaktifine (Invitrogen) monte edildi ve örnekler Zeiss Duo konfokal mikroskop kullanılarak analiz edildi.
VACV in vivo protein etiketleme
HeLa hücreleri 15 dakika boyunca 10 MOI'de VACV ile enfekte edildi, ortamla 2 kez yıkanıp ml başına 25 mikroL S. purpurea özütü/ortam ile tedavi edildi. S. purpurea ile tedavi edilmeyen hücreler, ml başına 25 mikroL %63 etanol, %5 gliserol çözeltisi (etanol/gliserol taşıyıcı)/ortam ile tedavi edildi. Hücreler, daha önce açıklandığı gibi [25], 4 hpi'de [35S]-metionin/sistein Protein Etiketleme Karışımı (Perkin-Elmer) ile etiketlendi. Hücre lizatları, SDS-PAGE ile %12 poliakrilamid jellerde analiz edildi, Whatmann filtre kağıdına kurutuldu ve otomatik radyografi ile analiz edildi.
Gerçek zamanlı PCR
HeLa hücreleri taklit enfekte edildi veya 15 dakika boyunca 10 MOI'de VACV ile enfekte edildi, ortamla 2 kez yıkanıp ml başına 25 mikroL S. purpurea özütü/ortam ile tedavi edildi. 4 hpi'de toplam RNA, üreticinin protokolüne göre Qiagen RNeasy Mini kiti ile izole edildi. Erken RNA seviyeleri, VACV-E3L mRNA'sı için spesifik primerler kullanılarak gerçek zamanlı PCR ile nicel olarak belirlendi. RNA konsantrasyonları eşitlendi ve gerçek zamanlı PCR, 1 veya 10 mikroL toplam RNA ile yapıldı.
Viral çekirdek in vitro transkripsiyon
VACV virion çekirdekleri daha önce açıklandığı gibi izole edildi [26]. Çekirdekler, belirtilen miktarlarda S. purpurea veya etanol/gliserol taşıyıcı ile inkübe edildi. In vitro transkripsiyon testleri, [35S]-UTP varlığında daha önce açıklandığı gibi yapıldı [26]. Virion çekirdekleri hariç tutularak bir şablonsuz reaksiyon yapıldı. Tüm reaksiyonlar Superase-In RNaz inhibitörü (Ambion) varlığında yapıldı. Tamamlanmış transkripsiyon reaksiyonları cam elyaf filtrelere damlatıldı, %10 TCA'da 3 kez yıkanıp radyoaktivite sintilasyon sayımı ile ölçüldü.
Sonuçlar
Sarracenia VACV replikasyonunu önledi
Başlangıç analizi, S. purpurea özütünün in vitro olarak çiçek hastalığı virüsü enfeksiyonlarını inhibe etme yeteneğini ölçmek için yapıldı. S. purpurea'nın, enfeksiyondan hemen sonra, toplam 24 saat boyunca bir kez veya her altı saatte bir verilen artan miktarlarda özüt ile tedavi edilen hücrelerde vaksinia virüsü (VACV) plak oluşumunu önleme yeteneğini inceledik. Artan miktarlarda S. purpurea özütü ile ilişkili, VACV plaklaşma verimliliğinde doz bağımlı bir azalma gözlemledik (Şekil 1a). S. purpurea'nın plaklaşma verimliliğindeki azalmadan sorumlu olduğundan emin olmak için, hücreler enfeksiyondan önce %63:%32:%5 etanol:damıtılmış su:gliserol (S. purpurea özütünün taşıyıcısı) ile tedavi edildi. Bu taşıyıcı tedavi, VACV plaklaşma verimliliğini etkilemedi (veriler gösterilmedi).
Ardından, tek döngülü koşullar altında, bir kez veya her altı saatte bir S. purpurea özütü ile tedavi edilen hücrelerde VACV'nin çoğalması yeteneğini inceledik. S. purpurea ile tedavi, VACV enfeksiyonundan hemen sonra başladı ve viral titreler her altı saatte bir belirlendi. Tedavi edilmeyen hücrelerle karşılaştırıldığında, S. purpurea tedavisi VACV replikasyonunda dramatik bir azalmaya neden oldu (Şekil 1b). Tek bir S. purpurea tedavisi, enfeksiyon süresi boyunca VACV replikasyonunda 100–1000 katlık bir azalmaya neden oldu, ancak yine de bazı viral replikasyonlar gözlemlendi. Her altı saatte bir taze özüt ile tedavi edilen hücrelerde, VACV replikasyonunda 10.000 katlık bir azalma gözlemlendi. S. purpurea ile yapılan çoklu tedaviler, VACV replikasyonunu tamamen ortadan kaldırdı, çünkü titreler enfeksiyon süresi boyunca artmadı. Taşıyıcı ile tedavi edilen hücrelerde, VACV, tedavi edilmeyen hücrelerde görülenlere benzer seviyelerde çoğaldı (veriler gösterilmedi). S. purpurea'nın çiçek hastalığı virüsü enfeksiyonunu tedavi etmek için kullanılmasının etkinliğini daha fazla belirlemek için, özüt ile ilişkili seçicilik indeksini (SI) belirledik. S. purpurea ile tedavi edilen hücrelerde, VACV replikasyonunu %50 oranında inhibe etmek için gereken doz 10–15 mikroL/ml iken, %50 sitotoksisiteye (CC50) neden olan doz 70–75 mikroL/ml olup, yaklaşık 5–7 SI değeri verdi (Şekil 1c). Önceki çalışmalar, çiçek hastalığı virüsü enfeksiyonları için zaten kanıtlanmış bir tedavi olan sidofovir'in (CDV) HFF hücrelerinde 6–6,2 SI değerine sahip olduğunu göstermiştir [15]–[18]. Sonuçlarımızı sidofovir ile karşılaştırmak için, VACV ile enfekte olmuş HeLa hücreleri sidofovir ile tedavi edildi ve viral inhibisyon ve hücresel toksisite ölçüldü (Şekil 1d). Sonuçlarımız, sidofovir için yaklaşık 30 mikrogram/ml EC50 değerini gösterdi, ancak sidofovir ile tedavi edilen HeLa hücrelerinde, 640 mikrogram/ml'ye kadar konsantrasyonlarda önemli bir toksisite gözlemlenmedi (320 mikrogram/ml'ye kadar bir doza gösterildi). Bu hücresel toksisite eksikliği, daha önce sidofovir ile tedavi edilen BSC-40 hücreleri için bildirilenlere benzerdi [33].
S. purpurea özütünün sidofovir'e viral inhibitör aktivitesini daha ayrıntılı bir şekilde karşılaştırmak için, viral kaynaklı sitopatik etki (CPE) inhibisyonu değerlendirildi. Şekil 1e'de gösterildiği gibi, VACV enfeksiyonu 4 HPI'ye kadar önemli bir CPE'ye neden oldu (Taklit ile VACV karşılaştırın). S. purpurea ile tedavi edilen benzer bir enfeksiyonda, viral CPE tamamen inhibe edildi (Şekil 1e). Enfeksiyon sidofovir ile tedavi edildiğinde, CPE hala gözlemlendi (Şekil 1e).
Sarracenia replikasyonu erken inhibe etti
Şekil 1e'deki sonuçlar, sidofovir ve S. purpurea'nın VACV replikasyon döngüsünde farklı hedefler üzerinde etki ettiğini ve S. purpurea'nın CPE'nin indüksiyonundan önce replikasyon döngüsünün erken bir aşamasında virüs replikasyonunu inhibe ediyor olabileceğini düşündürmektedir. S. purpurea ile ilişkili antiviral aktivitenin mekanizmasını anlamak için çeşitli tedavi programları test edildi. VACV ile enfeksiyondan önce gece boyunca tek bir doz S. purpurea ile tedavi edilen ve ardından yıkanan hücrelerde, VACV replikasyonunda hiçbir inhibisyon gözlemlenmedi, bu da özütün hücresel bir antiviral bileşen indüklemediğini düşündürmektedir. Ayrıca, saflaştırılmış bir VACV stokunun S. purpurea ile tedavi edilmesi, virüsün replikasyonunu etkilemedi, bu da özütün serbest virüs parçacıkları üzerinde doğrudan bir etkisi olmadığını göstermektedir. S. purpurea tedavisinin VACV replikasyonunu önlemede en etkili olduğu zamanı belirlemek için, çeşitli enfeksiyondan sonraki zamanlarda eklendiği zaman S. purpurea'nın VACV kaynaklı CPE'yi önleme yeteneğini inceledik. Bu testte, hücreler VACV ile enfekte edildi ve daha sonra enfeksiyondan sonraki belirtilen zamanlarda S. purpurea ile tedavi edildi. 6 hpi'de, hücreler VACV kaynaklı CPE açısından incelendi. Tedavi edilmemiş hücrelerde, özellikle hücre yuvarlaklaşması olmak üzere önemli VACV kaynaklı CPE gözlemlendi (Şekil 2a). Bununla birlikte, enfeksiyondan sonra 0, 15 ve 30 dakika (mpi) S. purpurea ile tedavi edilen hücrelerde CPE yoktu veya düşük seviyelerdeydi. 60 ve 120 mpi'de tedavi edilen hücrelerde önemli CPE gözlemlendi. Bu sonuçlar, Şekil 1e ile uyumludur; S. purpurea muhtemelen VACV replikasyonunda erken bir bileşeni (yani viral alım veya erken viral transkripsiyon/çeviri) hedefliyordu.
Çekirdek A5 proteininin siyan floresan proteine kaynaştırıldığı bir VACV yapısı kullanılarak, hücreye viral alımı izleyebildik. Şekil 2b'de gösterildiği gibi, VACV enfeksiyonu 4°C'de yapıldığında, virüs parçacıkları hücrenin çevresinde lokalize kaldı. Enfeksiyon 37°C'de yapıldığında, virüs parçacıklarının çoğu sitoplazmada gözlemlendi. S. purpurea varlığında 37°C'de benzer bir enfeksiyon yapıldığında, sitoplazmaya benzer bir viral lokalizasyon gözlemlendi (Şekil 2b). Bu, S. purpurea tedavisinin hücreye VACV alımını inhibe etmediğini düşündürmektedir.
S. purpurea tedavisinden sonra erken viral protein sentezinin inhibe edilip edilmediğini inceledik. VACV ile enfekte olmuş hücreler, enfeksiyondan sonraki çeşitli zamanlarda S. purpurea ile tedavi edildi ve hücre lizatları, toplam VACV proteinlerine veya erken VACV proteinine, E3L'ye karşı yönlendirilmiş antikorlar kullanılarak Western blot ile analiz edildi. S. purpurea ile enfeksiyondan sonra 0, 15 ve 30 dakika tedavi edilen hücrelerde 3 ve 6 hpi'deki VACV protein sentezi büyük ölçüde azaldı (Şekil 2c). Özellikle, S. purpurea, VACV-E3L proteininin yokluğunda görüldüğü gibi erken VACV protein sentezini azalttı. Aksine, S. purpurea tedavisi, enfeksiyondan 60 ve 120 dakika sonra eklendiğinde viral protein seviyeleri üzerinde sadece marjinal etkiler gösterdi. Hücreler ayrıca, S. purpurea tedavisinden sonra viral protein sentezini hücresel protein senteziyle karşılaştırmak için [35S]-metionin ile metabolik olarak etiketlendi. Hücresel toksisite verilerine (Şekil 1c) dayanarak tahmin edildiği gibi, S. purpurea viral protein sentezini inhibe ederken, hücresel protein sentezi etkilenmeden kaldı (Şekil 2d). Topluca, bu veriler S. purpurea tedavisinin VACV erken protein birikimini önlemede etkili olduğunu ve viral alım ile erken viral protein sentezi arasında bir noktada etki ettiğini göstermektedir.
Sarracenia VACV transkripsiyonunu inhibe etti
S. purpurea tedavisinden sonra etkilenen erken viral aşamasını daha ayrıntılı bir şekilde anlamak için, gerçek zamanlı PCR kullanarak VACV ile enfekte olmuş hücrelerdeki erken VACV-E3L mRNA seviyelerini nicelendik. Toplam RNA, taklit enfekte edilmiş, VACV ile enfekte edilmiş veya VACV ile enfekte edilmiş ve ardından tek bir doz S. purpurea özütü ile tedavi edilmiş hücrelerden izole edildi. S. purpurea tedavisi, enfekte olmuş hücrelerde bulunan VACV-E3L mRNA seviyelerinde dramatik bir azalmaya neden oldu (Şekil 3a). Döngü eşik değerlerine (C(t)) göre, tedavi edilen hücrelerdeki erken VACV mRNA seviyeleri 393–474 kat azaldı.
VACV replikasyonunun erken viral transkripsiyon seviyesinde bloke edilip edilmediğini belirlemek için, saflaştırılmış VACV virion çekirdekleri ve [3S]-UTP kullanarak bir in vitro transkripsiyon testi gerçekleştirdik. Artan miktarlarda S. purpurea veya taşıyıcı ile tedavi edildikten sonra meydana gelen VACV transkripsiyonu miktarı, yeni sentezlenmiş viral mRNA'ya dahil edilen [3S]-UTP miktarını nicelleştirerek ölçüldü. Gösterildiği gibi, VACV transkripsiyonu S. purpurea miktarı arttıkça azalırken, taşıyıcı ile tedavi edilen çekirdeklerdeki transkripsiyon seviyeleri nispeten eşit kaldı (Şekil 3b). Transkripsiyonu tamamen inhibe etmek için gereken S. purpurea miktarı, VACV replikasyonunu önleyen doza benzerdi (Şekil 1b). Zaten RNA sentezleyen VACV çekirdeklerine S. purpurea ilavesi, RNA seviyelerini azaltmadı, bu da özütün içsel RNaz aktivitesine sahip olmadığını düşündürmektedir (veriler gösterilmedi).
Sarracenia antiviral aktivitesi
S. purpurea ile ilişkili anti-çiçek hastalığı virüsü aktivitesini daha ayrıntılı bir şekilde anlamak için, S. purpurea'nın Orthopoxvirüs cinsinin daha virülent üyelerinin, yani maymun çiçeği virüsünün (MPXV) ve variola virüsünün (VARV) replikasyonunu önleme yeteneğini analiz etmeye karar verdik. Hücreler taklit enfekte edildi veya MPXV ile enfekte edildi ve daha sonra belirtilen zamanlarda tedavi edilmeden bırakıldı veya S. purpurea veya taşıyıcı ile tedavi edildi. Başarılı bir MPXV enfeksiyonunun olup olmadığını belirlemek için MPXV-F3L proteininin (VACV-E3L proteininin ortologu) varlığı için Western blot'lar yapıldı. Özüt ile enfeksiyondan sonra 0 veya 15 dakika tedavi edildiğinde, S. purpurea tedavisi MPXV-F3L proteininin birikimini önledi, oysa tedavi edilmemiş ve taşıyıcı ile tedavi edilmiş hücrelerde yüksek seviyelerde MPXV-F3L tespit edildi (Şekil 4a). Benzer bir test, hücrelerin taklit enfekte edildiği veya VARV ile enfekte edildiği ve belirtilen dozlarda S. purpurea veya taşıyıcı ile tedavi edildiği VARV ile yapıldı (Şekil 4b). VARV E3L proteininin varlığı için yapılan Western blot'lar, S. purpurea ile tedavi edilen enfeksiyonlarda VARV-E3L proteininin birikiminde konsantrasyon bağımlı bir inhibisyon gösterdi. Ayrıca, S. purpurea tedavisinin tavşan çiçek hastalığı virüsü erken protein birikimini etkili bir şekilde inhibe ettiğini de belirledik (veriler gösterilmedi).
S. purpurea tedavisinin Poxviridae ailesinin dışındaki diğer virüslere karşı etkili olup olmadığını belirlemek için, adenovirüs (Adeno) (Adenoviridae, DNA genomu), veziküler stomatit virüsü (VSV) (Rhabdoviridae, (-) anlam RNA genomu), fare hepatit virüsü (MHV) (Coronaviridae, (+) anlam RNA genomu) ve reovirüs (Reo) (Reoviridae, dsRNA genomu) dahil olmak üzere dört ilgili olmayan virüsün replikasyonunu bloke etme yeteneğini analiz ettik. S. purpurea ile tedavi edildikten sonra test edilen dört virüsün hiçbirinde viral protein sentezinde önemli bir azalma tespit edilmedi (Şekil 4c). Ayrıca, S. purpurea'nın ensefalomiyokardit veya VSV plak oluşumunu etkilemediğini de belirledik (veriler gösterilmedi).
Son olarak, diğer bitkisel özütlerin VACV replikasyonunu önleyip önleyemeyeceğini belirlemek istedik. Bu testte, Echinacea, Astragalus, Coriolus ve Glycyrrhiza bitkisel özütlerinin VACV protein sentezi ve plak oluşumu üzerindeki etkisini incelemeyi seçtik. Bu bitkisel özütlerin diğer mikrobiyal enfeksiyonların tedavisinde etkili olduğu düşünülmektedir [28]. Enfekte olmuş hücreler her bir özüt ile tedavi edildi ve VACV-E3L protein sentezi seviyeleri için analiz edildi. Tüm bitkisel özütler, S. purpurea özütü ile karşılaştırılabilir miktarlarda uçucu olmayan bileşenler içeriyordu. Gösterildiği gibi, S. purpurea ile tedavi edilen hücrelerdeki VACV-E3L seviyeleri dramatik bir şekilde azaldı (Şekil 4d). Bununla birlikte, diğer dört bitkisel özüt ile tedavi edilen hücreler, tedavi edilmemiş hücrelerde görülenlere benzer VACV-E3L seviyeleri içeriyordu. Ayrıca, VACV plaklaşma oluşumu diğer bitkisel özütlerden etkilenmedi (veriler gösterilmedi).
Tartışma
Burada, tarihsel olarak çiçek hastalığı enfeksiyonuyla ilişkili semptomları önlediği bildirilen bir S. purpurea özütü ile ilişkili anti-çiçek hastalığı virüsü aktivitesinin in vitro karakterizasyonunu bildiriyoruz [3], [4], [6], [7], [10], [12]. 1800'lerde, hastalar çiçek hastalığı semptomları zaten ortaya çıktıktan sonra ve salgınlar sırasında önleyici olarak S. purpurea ile tedavi edildi. Tarihsel raporlar, “etkiler o kadar… hızlı ve faydalıydı ki, Sarracenia'dan kaynaklandıklarından şüphe yoktu” [8]. “(S. purpurea) uygulanana kadar hastalık çok şiddetli devam etti ve uygulamadan sonra şiddetinde tamamen değişti, etki yalnızca (S. purpurea)'dan kaynaklanıyordu” [1]. Bu çalışmada, S. purpurea özütlerinin çeşitli Ortopoxvirüslerin viral replikasyonunu ve viral kaynaklı sitopatik etkilerini etkili bir şekilde inhibe edebildiğini gösterdik. Veriler, S. purpurea'nın MPXV ve VARV replikasyonunu VACV'ye benzer şekilde etkili bir şekilde inhibe ettiğini ve daha virülent MPXV ve VARV'nin bir modeli olarak VACV'nin kullanılmasının önemini göstermektedir. Virüs replikasyonunun inhibe edildiği dozlarda, çok az veya hiç hücresel toksisite gözlemlenmedi.
Geniş spektrumlu antiviral aktivite ile ilgili olarak, veriler, test edilen diğer ilgili olmayan virüslere kıyasla, S. purpurea ile ilişkili antiviral aktivitenin en azından kısmen çiçek hastalığı virüslerine özgü olduğunu desteklemektedir. S. purpurea ile tedavi edilen hücreler hala diğer virüs ailelerinin çoğalmasını destekleyebildiğinden, S. purpurea tedavisinin hücrenin hücre içi ortamını bozmadığını daha da desteklemektedir. VACV için tek bir tedavi viral replikasyonu önlemede oldukça etkiliydi, ancak kısmi replikasyon kısa süre sonra muhtemelen özüt içindeki aktif bileşen(ler)in parçalanması veya kullanımı nedeniyle tekrar başladı. Bununla birlikte, hücrelerin her altı saatte bir taze S. purpurea ile tedavi edilmesi VACV'nin replikasyonunu tamamen ortadan kaldırdı. Bu, hastaların geçmişte günde 4-6 doz özüt almayı içeren tedavi rejimiyle nasıl tedavi edildiğiyle iyi bir şekilde örtüşmektedir [11]. Verilerimiz, S. purpurea özütlerinin in vitro olarak VACV, MPXV ve VARV'nin replikasyonunu etkili bir şekilde inhibe ettiğini desteklemektedir. Ortopoxvirüsler üzerindeki bu aktivite, S. purpurea'nın çiçek hastalığı enfeksiyonlarına karşı bir tedavi olarak tarihsel raporlarıyla tutarlıdır. Bu çalışmanın amacı, 1800'lerde tarihsel olarak yapılanlara benzer hazırlama yöntemleri altında bitkisel materyali doğrulamak ve değerlendirmek için S. purpurea özütlerinin anti-çiçek hastalığı virüsü aktivitesini karakterize etmektir. Topluca, veriler S. purpurea'nın viral replikasyonda inhibisyona yol açan erken viral transkripsiyonu hedeflediğini düşündürmektedir. Diğer bitkisel ürünlerle karşılaştırıldığında, veriler S. purpurea özütünün anti-çiçek hastalığı virüsü aktivitesinin diğer bitkisel ürünler tarafından paylaşılmadığını göstermektedir. Sunulan sonuçlara göre, gelecekteki çalışmalar S. purpurea özütlerinde bulunan aktif anti-çiçek hastalığı virüsü bileşen(ler)inin fraksiyonasyonunu ve tanımlanmasını içerecektir. Sidofovir (CDV), çiçek hastalığı virüsleri dahil olmak üzere çeşitli DNA virüslerine karşı aktiviteye sahip geniş spektrumlu bir antiviraldir. Şu anda CDV, anti-çiçek hastalığı virüsü aktivitesine sahip tek lisanslı parenteral ilaçtır, ancak klinik kullanımı Araştırma Yeni İlaç (IND) durumu tarafından yönetilmektedir [30]. CDV nefrotoksisiteye yol açtığı ve intravenöz olarak uygulanması gerektiği için, CDV çiçek hastalığı virüsü enfeksiyonlarını tedavi etmek için standartlaştırılmış tedavi olarak aranmamıştır [20]. CDV'yi hekzadekil propandyal alkoksikanola bağlayarak sentezlenen CMX001, şu anda oral uygulamadan sonra artan biyoyararlanabilirlik ve tahmin edilen nefrotoksisite eksikliği nedeniyle CDV'ye alternatif olarak araştırılmaktadır [31]. Başka bir bileşik olan ST-246 (Tecovirimat), çiçek hastalığı virüslerinin tedavisinde oldukça etkili olduğu gösterilmiştir. ST-246 oral yoldan verilebilir ve bir hayvan modelinde toksik olmadığı bildirilmiştir [21], [32]. Bugüne kadar ST-246 ve CMX001 en umut verici anti-çiçek hastalığı virüsü bileşikleridir. Tıp Enstitüsü tarafından yayınlanan bir rapor ve 2009 Variola Virüsü Araştırma Konusunda Dünya Sağlık Örgütü Danışma Komitesi, insan nüfusunun çiçek hastalığına karşı artan duyarlılığı nedeniyle, çiçek hastalığı salgını durumunda daha fazla koruma sağlamak için farklı etki mekanizmalarına sahip en az iki anti-variola virüsü ilacının geliştirilmesi gerektiğini öne sürdü [22]. ST-246 ve CMX001 güçlü verimliliğe sahiptir ve viral replikasyon döngüsünde farklı noktaları hedefler, ancak çiçek hastalığı virüsü genomundaki tek nokta mutasyonları bu ilaçlara direnç kazandırabilir. Bu nedenle, ek anti-çiçek hastalığı virüsü terapileri kesinlikle insan nüfusunu korumaya yardımcı olacak ve mevcut tedavilerin repertuarını artıracaktır.
S. purpurea ile ilişkili etkinliğin bir ölçümü olarak, SI'nın daha önce CDV için bildirilenlere benzer olduğu belirlendi [15], [16]. Anecdotall olsa da, 1800'lerin sonlarında S. purpurea özütleri kullanıldığında, tedaviden sonra hiçbir ciddi yan etki bildirilmedi [1], [2], [7], [8], [9], [12]. Sarracenia özütlerinin ABD