Bugün öğrendim ki: 60 göbek deliğinin örneklendiği ve 2368 farklı bakteri türü keşfedilen bir göbek deliği bakteri çalışması; bunlardan 1458'i bilim için yeniydi. Birinde Japon toprağında bulunan garip bir bakteri vardı ve hiç Japonya'ya gitmemişlerdi. Hiçbir bakteri tüm düğmelerde ortak değildi.
Giriş
Ortalama bir insanın derisi, yüzlerce hatta binlerce filotipi temsil eden trilyonlarca ayrı bakteri barındırır [1]. Bu filotiplerin veya "türlerin" (bakteri tür tanımlarının belirsiz olduğunu kabul ederek [2]) çoğu henüz adlandırılmamıştır [3] ve genellikle kültüre alınmaları zor olduğundan yalnızca nükleotid dizilerine dayanarak bilinirler. Çalışmalar, vücudumuzun coğrafyasında, örneğin ıslak (örneğin koltuk altı) ve kuru (örneğin önkol) yaşam alanları arasında bakteri taksonlarının bileşiminde tutarlı farklılıkları karakterize etmeye başlamıştır [1], [4]. Ancak, bu tür yaşam alanlarındaki çeşitliliğin nasıl yapılandırıldığı ve özellikle bazı filotiplerin neden yaygın, diğerlerinin neden nadir olduğu hala net değildir. Yaygınlık, tarihsel olarak rastgele veya şans olaylarının sonucu olabilir [5], yaygın filotiplerin farklı insanlarda veya insan gruplarında tahmin edilemez şekillerde farklılık göstermesini bekleyebiliriz. Alternatif olarak, yaygın filotipler, bulunduğu ortamda tahmin edilebilir bir başarıya yatkınlık gösteren soyumlardan kaynaklandıkları için tahmin edilebilir şekilde yaygın olabilirler [4], [6], [7].
İnsan vücudundaki bakterilerin farklı filotiplerinin yaygınlığının tahmin edilebilir olup olmadığını test etmek için, iki bağımsız Kuzey Amerikalı örneğinden yeni toplanan deri bakteri ve arkea örneklerini karşılaştırdık. Örnekler, ulusal bir vatandaş bilimi projesi olan Karın Düğmesi Biyoçeşitliliği (http://www.wildlifeofyourbody.org/) kapsamında gönüllülerden toplanmıştır ve gönüllülerin mikrobiyal toplulukları, 16S rDNA kütüphanelerinin çoklu pirosekvenlaması kullanılarak değerlendirilmiştir. Tropikal ağaçlar veya tatlı su balıkları gibi ortak ve nadir çok hücreli türlerdeki araştırmalardan türetilen iki tahmini test ettik. Test ettiğimiz ilk iki tahmin şu şekildeydi: 1) bir insan popülasyonunda sık görülen filotipler, diğerlerinde de tahmin edilebilir şekilde sık görülmeli ve 2) sık görülen filotipler, mevcut olduklarında da bol olmalıdır [7], [8]. Sık görülen filotipler, birçok insanda bulunan filotipler olarak tanımlanırken, bol filotipler, bulunduğu insanlarda çok sayıda (yani, pirosekvenlama çıktısında çok sayıda 16S rDNA "okuma" ile temsil edilen) bulunan filotiplerdir. Teorik olarak, bir filotipin bolluğu (var olduğunda çok fazla okuma) olsa bile, çok nadir olabilir. Uzun zamandır, birçok topluluğun (balık, bakteri veya başka bir şey olsun) birkaç istisnai derecede sık ve/veya bol türden ve çok daha fazla nadir türden oluştuğu bilinmektedir [9], [10], az sayıda çalışma, bol türlerin bölgelere veya, bizim durumumuzda, konakçı popülasyonlarına göre aynı eğilime sahip olup olmadığını karşılaştırıyor gibi görünmektedir.
Yağmur ormanı ağaçları bağlamında, hem örnekler arasında hem de mevcut olduklarında bol olan türler "oligarklar" olarak adlandırılmıştır [6]. Balık toplulukları bağlamında, "çekirdek türler" olarak adlandırılmışlardır (daha sonra "ara sıra türler" ile karşılaştırılmıştır) [7]. Oligarşi veya çekirdek tür kavramları, mikrobiyolojik "çekirdek mikrobiyom" kavramına benzer ancak daha spesifiktir (karmaşayı önlemek için burada "çekirdek tür" yerine "oligarşi" terimine odaklanacağız). Çekirdek mikrobiyomun iki nispeten ayrı tanımı vardır. Bazı bağlamlarda, çekirdek mikrobiyom, bireyler arasında neredeyse evrensel olan bir dizi gen ve metabolik işlev olarak tanımlanır [11], [12], çoğu durumda var olan filotiplerin hangisi olduğundan nispeten bağımsızdır. Diğer bağlamlarda, çekirdek mikrobiyom terimi, odak noktasımızla daha doğrudan bağlantılı bir anlamda kullanılmaktadır; burada çekirdek mikrobiyom, örnekler arasında neredeyse evrensel olan bir dizi filotipi tanımlayan bir terimdir [13]. Oligarşi kavramı, filotiplerin sıklığı ve bolluğunun tahmin edilebilir olup olmadığını istatistiksel olarak dikkate alarak "çekirdek mikrobiyomun" bu ikinci tanımını genişletir veya örneklerin taksonomik olarak tahmin edilemez gövdeler olup olmadığını belirtir.
Sık görülen filotipler, insan konakçılar arasında ve/veya rekabetçi başarı için belirli uyarlamalara sahip olan filotipler olabilir. Başarı belirli uyarlamalarla ilişkilendirilmişse ve bu uyarlamaların evrimleşmesi zorsa, sık görülen türlerin filogenetik olarak kümelenmesini bekleyebiliriz [14], [15]. Alternatif olarak, başarı, karın düğmeleri veya daha genel olarak vücutlar üzerinde hayatta kalmak için belirli uyarlamalardan bağımsızsa, başarı yalnızca nötr veya rastgele süreçlerin bir fonksiyonu olabilir [16] veya başarı için gerekli özellikler kolayca evrimleşebilir. Bu bağlamda, üçüncü bir hipotezi test ettik: yani, en sık karşılaşılan bakteri filotipleri (varsayılan oligarklarımız, örneklenen bireylerin %50'sinden fazlasında bulunan) rastgele seçilen filotipler arasında beklenenden daha yakın bir ilişkiye sahip olma eğilimindedir, yağmur ormanı ağaçları için olduğu gibi önerilmiştir [6].
Analizlerimizdeki insan deri bakteri örnekleri, iki ayrı vatandaş bilimi örnekleme etkinliği sırasında toplanmıştır. İki ayrı grup birey (ilk etkinlikte 35, ikincisinde 25) kendi karın düğmelerini süngerlemek için gönüllü olmuştur. Vatandaşlar, bu çalışmaya sadece örneklemekle kalmayıp, aynı zamanda hipotez oluşturmada (twitter ve çevrimiçi yorumlar aracılığıyla) ve veri görselleştirmede de yer almışlardır ve örneklerinin bakteri kültürleri (www.wildifeofyourbody.org) ve moleküler çalışmalarda keşfedilen filotiplerin listeleri ile sağlanmışlardır. Bakteriler, derinin tüm kısımlarında yaygındır, ancak karın düğmesi birkaç avantaj sunar. Morfoloji açısından (örneğin, karın ile karşılaştırıldığında) kişiden kişiye göre nispeten değişmeyen bir ortamdır. Günlük ovma işleminden uzak kalmaktadır ve özellikle eller gibi sık yıkanan ve açıkta kalan vücut kısımlarıyla karşılaştırıldığında daha az bozulmuş bir bakteri topluluğuna ev sahipliği yapma potansiyeline sahiptir [4]. Ve son olarak, karın düğmesinden örnekleme, halka arasında büyük ilgi gördü ve bu da insanlarla en yakın ilişkide olan türlerin tartışılmasına dikkat çekmeye yardımcı oldu, bu da daha geniş çalışmalarımızın temel bir amacıdır (www.yourwildlife.org).
Materyal ve Yöntemler
a) Bakteri Örnekleri
Geçtiğimiz altı ay içinde, karın düğmesi bakterileri için beş yüzün üzerinde gönüllüden örnek topladık. İlk iki alt örneğe (toplamda 60 birey): bilim iletişimcilerinin ScienceOnline toplantısından bir örnek (13-15 Ocak 2011, Raleigh, NC, ABD) ve Raleigh, NC'deki Doğal Bilimler Müzesi'ndeki Darwin Günü'nden bir örnek (12 Şubat 2011) odaklanıyoruz. Tüm katılımcılara, Kuzey Carolina Eyalet Üniversitesi'nin İnsan Araştırma Komitesi tarafından onaylanmış (Onay No. 1987) yazılı Bilgilendirilmiş Onay formu verilmiştir. Üniversitenin İnsan Araştırma Komitesi bu çalışmayı onayladı. Karın düğmeleri, daha sonra 0,5 ml %10 fosfatlı tuzlu çözeltiye batırılan steril pamuklu uçlar kullanılarak süngerlendi. Süngerlemenin, insan deri bakterilerini örneklemek için diğer örnekleme yöntemleri kadar etkili olduğu daha önce belirlenmiştir (7). Örnekler -20°C'de saklandı. Santrifüjlenmiş örneklerin çökeltisinden 50 µL genomik DNA, Lauber vd.'nin modifikasyonuyla PowerSoil DNA ekstraksiyon kiti (MoBio, Inc.) kullanılarak çıkarıldı [17]. Amplikonlar, evrensel bakteri/arkea primerleri 515F ve 806R'nin bir kombinasyonu kullanılarak üretildi [18]. 515F primerine bir TC bağlantı elemanı ve bir Roche 454 B pirosekvenlama adaptörü eklendi ve 806R primerine 12 bp'lik örnek özel barkod dizisi, bir CA bağlantı elemanı ve bir Roche 454 A sıralama adaptörü eklendi. Örnek özel, hata düzeltmeli barkod, tüm amplikonları tek bir pirosekvenlama çalışmasında birleştirmeyi mümkün kıldı. Tüm örnekler, şablonsuz kontroller dahil, [18], [19]'da açıklanan protokol uyarınca üçlü olarak PCR-amplifikasyonu yapıldı. Amplikonlar, UltraClean-htp 96 delikli PCR Temizleme kiti (MoBio) kullanılarak temizlendi. Her amplikona ait konsantrasyon, Quant-iT PicoGreen dsDNA kiti (Invitrogen) kullanılarak belirlendi ve tüm örneklerin eşit molar dilimleri birleştirildi. Pirosekvenlama, Engencore (Güney Carolina Üniversitesi, ABD) tarafından Titanium kimyası kullanan bir Roche Genome Sequencer FLX sisteminde gerçekleştirildi. Ekibimiz insan mikrobiyomu üzerine önceki çalışmalarımızda (örneğin [4]) bu yöntemle önemli başarılar elde ettiğinden, 454 platformu diğer platformlardan daha iyi seçildi. Ayrıca, 454 pirosekvenlamasının ürettiği okumalar, çoğu diğer yöntemden önemli ölçüde daha uzundur ve bu nedenle analiz edilmesi ve yorumlanması daha kolaydır.
b) Dizi Verisi Analizleri
Pirosekvenlama çıktısı, 454 platformu içinde ilk kalite ekranından geçen 144.403 okumadan oluştu. Bu çıktı, mikrobiyal toplulukların barkodlu amplikonları için kapsamlı analiz paketi QIIME kullanılarak işlendi ve analiz edildi [20]. Aşağıda açıklanan tüm analiz adımları QIIME paketinin bir parçasıdır. Sıralama çıktısı, uzunluğu >200 ve <1000 bp olan, ortalama kalite puanı >25 ve hiçbir belirsiz karakter içermeyen dizilerden oluşacak şekilde filtrelendi. Diziler, 12 bp'lik barkoda göre örneklendirildi; yalnızca 50 dizide düzeltilemeyen barkod dizisi vardı. %97'nin üzerinde benzerlik gösteren diziler, uclust yöntemini kullanarak İşlevsel Taksonomik Birimler (OTU'lar) olarak gruplandırıldı. Tüm OTU'lardan temsili diziler, PyNAST [21] kullanılarak RDP şablonuna göre hizalandırıldı ve her OTU'nun taksonomik kimliği, minimum hizalama uzunluğu 190 ve minimum dizi benzerliği %70 olan RDP Sınıflandırıcısı kullanılarak belirlendi. Özelleştirilmiş mikrobiyal taksonların örneklerdeki okuma sayıları (bolluğun bir göstergesi), sonraki topluluk analizlerinde kullanılmak üzere bir matris olarak ihraç edildi. Tüm örnekler, alt analizlerden önce örnek başına 400 okuma sıralamasına kadar seyreltildi. Veri setindeki tek kopya sayılarının sıralama artefaktları olmadığını doğrulamak için, QIIME'da RDP sınıflayıcısı tarafından tanımlanamayan yirmi tek kopya OTU'sunun (şifreli şüpheler) doğrudan GenBank ile manuel bir şifreli karşılaştırma gerçekleştirildi. Bu yirmi dizinin hiçbiri şifreli değildi, bu nedenle şifreler, veri kümemizde nadir ve önemsiz olsa bile, mevcut olabilir diye sonuçlandırdık.
c) Analizler
İnsanlar arasında bakteri filotiplerinin sıklığı ve bolluğunun tahmin edilebilir olup olmadığını test etmek için, iki bağımsız birey grubunda bulunan taksonların sıklıkları arasında Spearman sıra korelasyonu hesapladık. Bu, çoğunlukla yalnızca bir bireyde bulunan ve dolayısıyla tanım gereği gruplar arasında sıklık ve bolluk açısından ters orantılı olan çok nadir taksonları dışlar. Örnekler 35 ve 25 bireyden oluşuyordu ve her ikisinde de 305 takson gözlemlendi. Ayrıca, Spearman'ın sıra korelasyonunu, (iki örnekleme etkinliği birleştirildiğinde) en sık görülen filotiplerin ayrıca karşılaştıklarında en bol olan filotipler (okuma sayısı) olma derecesini ölçmek için kullandık.
Son olarak, en sık görülen bakteri filotiplerinin (%50'den fazla birey üzerinde bulunan 23 filotiple) rastgele seçilen filotiplerden aynı sayıda filotiplerden daha yakın bir şekilde ilişkili olup olmadığını inceledik. Sık görülen filotiplerin insanlarda yaşam için adaptasyona sahip az sayıda soyumdan kaynaklanmasına, nadir filotiplerin ise daha geniş bir çevresel bakteri yelpazesinden rastgele örnekler olmasına neden olabilir. Örneğin, yaygın yağmur ormanı ağaç türlerinin önemli bir oranı, tropikal orman yaşamı için çeşitli benzersiz uyarlamalara sahip olan palmiye ailesindendir [6]. Benzer şekilde, yalnızca "çekirdek" haliç balığı türleri haliç yaşamına uyum sağlayabilir, çok daha fazla ara sıra türün biyolojik olarak bu yaşam alanları ile ilişkilendirilmediği gözlemlenmiştir [7]. Nadir, daha ara sıra türler, bir habitata girebilir, ancak gerekli başarıyı gösteremeyebilir. Bu durumda, insanlar üzerinde sıklıkla karşılaştığımız bakteriler, aynı sayıda daha az sık görülen türden rastgele çekilenlerden daha az soya ait olmalıdır. Karın düğmelerindeki örneklerimizde, en sık karşılaşılan bakteri filotiplerinin, kalan bakterilerden aynı sayıda temsilcinin rastgele seçilmişlerinden daha filogenetik olarak kümelenmiş olduğunu bulduk. En yaygın filotipler arasında (örneklenen insanların %50'sinden fazlasında bulunan 23 filotiple) ortalama ikili filogenetik uzaklık 0.070'dir (Kimura 2 parametreli), kalan filotiplerden 23 filotipin rastgele seçilmiş kümelerindeki uzaklıkların %95 aralığının dışında kalmaktadır (ortalama= 0.100, alt %95 niceliği=0.078, Şekil 2). Bu sonuçlar, insan vücudunun binlerce bakteri filotipiyle karşılaşırken, en başarılı filotiplerin yalnızca birkaç soydan kaynaklandığı hipotezini desteklemektedir. Evrimsel tarih boyunca, bu soyların insanlar üzerinde gelişip başarıya ulaşmalarına izin veren özellikler geliştirmiş olduğu düşünülmektedir. Bulduğumuz en yaygın ve bol olan soylar, insan derisinde bulunan zor ve çöl benzeri koşullar için özel adaptasyonlara sahip olduğu düşünülenlerle neredeyse özdeştir [26], [30].
En sık görülen 23 filotipe ait (aynı zamanda ortalama olarak bol olan ve karşılaştığımız bakteri okumalarının %50'sini oluşturan) çok az, ilişkili soydan kaynaklanmıştır (yeşil; örneklerin %50'sinden fazlasında bulunan 23 filotipin ortalama ikili Kimura 2 parametreli uzaklığı = 0.070), geri kalan filotipler ise filogenetik olarak dağılmıştır (mavi histogram; kalan 2345 filotiple arasındaki ortalama ikili filogenetik uzaklık dağılımı).
Sonuçlar
Genel olarak, karın düğmesi bakteri filotiplerinin çeşitliliğini belirlerken, bu çeşitliliğin bazı yönlerinin tahmin edilebilir olduğunu bulduk. En sık ve bol filotipler, bağımsız popülasyonlarda ve aynı zamanda filogenetik olarak kümelenmiş olarak benzerdi. Tropikal ormanların çalışıldığı araştırmalarda, hem tahmin edilebilir şekilde sık hem de mevcut olduğunda bol bulunan türler oligarklar [6] olarak adlandırılmıştır, burada da biz bu terimi kullanıyoruz veya ekolojik literatürde başka yerlerde kullanılan "çekirdek türler" terimi [7].
Bu oligarklar, örneklenen insan bireylerinin çoğunda birden fazla okuma ile temsil edilmiştir, ancak bunlardan hiçbiri tüm örneklerde mevcut değildir. Bu, oligarşi kavramı veya ekolojik çekirdek türler kavramıyla uyumlu görünmektedir, ancak tüm örneklerde bulunan bir dizi takson olarak tanımlanan geleneksel çekirdek mikrobiyom kavramıyla uyumlu değildir [13]. Bu tür filotipler, çalışmalarımızdaki tüm insanlarda mevcut olabilir ancak algılanmamış olabilir. Ancak, oligarkların mevcut olduğunda bol olma eğiliminde olmaları ve en az olası gözden kaçırılan filotipler olmaları göz önüne alındığında, sonuçlarımız "çekirdek mikrobiyom"un diğer taksonların çok işlevsel bir fazlalığa sahip olması nedeniyle gen ve metabolik işlev düzeyinde istikrarlı, ancak taksonomik bileşiminde esnek olarak tanımlandığı alternatif açıklamaya daha uygundur [11], [12], olsa da, önemli bir farkımız var. İnsan karın düğmeleri mikrobiyal topluluklarının taksonomik bileşiminde bir derece esneklik gösterebileceğini, ancak işlevsel olarak fazlalıklı bir meta topluluğun rastgele bir topluluğundan çok daha tahmin edilebilir göründüğünü bulduk. Önemli bir şekilde, bu tahmin edilebilir taksonomik bileşim modeli ağırlıklı olarak oligarklar tarafından oluşturulmuştur - sık görülen, bol, filogenetik olarak kümelenmiş simbiyotlar, topluluğun geri kalanı ise çok daha rastgele görünmektedir. Özellikle, bir bakteri topluluğunun farklı türler arasındaki farklılıkları dikkate almadan aynı anda analiz edilmesi, hem bir insan grubundan diğerine tahmin edilebilirlikleri hem de çok farklı uzamsal ölçeklerde balık ve tropikal ağaçlar gibi diğer taksonlarda gözlemlenen örüntülerle geniş bir uyum içinde olması nedeniyle olası taksonomik örüntüleri gizleyebilir [31].