Bugün öğrendim ki: Gözyaşında, tükürükte, anne sütünde ve mukusta bulunan, bazı bakterilerin hücre duvarını sindirerek etki gösteren antimikrobiyal bir enzim vardır.
Hayvanlar tarafından üretilen antimikrobiyal enzim
Lizozom, Lizozomal enzimler veya Lizin ile karıştırılmamalıdır.
LizozimTanımlayıcılarEC no.3.2.1.17CAS no.9001-63-2 VeritabanlarıIntEnzIntEnz görünümüBRENDABRENDA girişiExPASyNiceZyme görünümüKEGGKEGG girişiMetaCycmetabolik yolPRIAMprofilPDB yapılarıRCSB PDB PDBe PDBsumGen OntolojisiAmiGO / QuickGO
AramaPMCMakalePubMedmakaleNCBIproteinler
Protein ailesi
Glikozit hidrolaz, aile 22, lizozimTanımlayıcılarSembol?InterProIPR000974
Mevcut protein yapıları:PDB IPR000974 AlphaFold
Lizozim (EC 3.2.1.17, muramidaz, N-asetilmuramid glikanhidrolaz; sistematik adı peptidoglikan N-asetilmuramoilhidrolaz), hayvanlar tarafından üretilen ve doğal bağışıklık sisteminin bir parçasını oluşturan bir antimikrobiyal enzimdir. Bir peptidoglikan içindeki N-asetilmuramik asit ile N-asetil-D-glukozamin kalıntıları arasında ve kitodekstrinlerdeki N-asetil-D-glukozamin kalıntıları arasında (1→4)-β-bağlarının hidrolizini katalize eden bir glikozit hidrolazdır.
Peptidoglikan, gram-pozitif bakteri hücre duvarının ana bileşenidir.[1] Bu hidroliz, bakterilerin hücre duvarlarının bütünlüğünü bozarak bakterilerin lizisine (parçalanmasına) neden olur.
Lizozim; gözyaşı, tükürük, insan sütü ve mukus dahil olmak üzere salgılarda bol miktarda bulunur. Ayrıca makrofajların ve polimorfonükleer nötrofillerin (PMN'ler) sitoplazmik granüllerinde de bulunur. Yumurta akında büyük miktarlarda lizozim bulunabilir. C-tipi lizozimler, dizi ve yapı olarak α-laktalbümin ile yakından ilişkilidir, bu da onları aynı glikozit hidrolaz ailesi 22'nin bir parçası yapar.[2] İnsanlarda C-tipi lizozim enzimi LYZ geni tarafından kodlanır.[3][4]
Tavuk yumurtası akı lizozimi, pH 5.0'da 72 °C'ye varan erime noktası ile ısıl olarak kararlıdır.[5] Ancak insan sütündeki lizozim, bu sıcaklıkta aktivitesini çok çabuk kaybeder.[6] Tavuk yumurtası akı lizozimi, geniş bir pH aralığında (6–9) aktivitesini korur.[7] İzoelektrik noktası 11.35'tir.[7] İnsan sütü lizoziminin izoelektrik noktası 10.5–11'dir.[8]
İşlev ve mekanizma
[düzenle]
Enzim, peptidoglikanlardaki glikozit bağlarını hidrolize ederek çalışır. Enzim ayrıca kitindeki glikozit bağlarını da kırabilir, ancak gerçek kitinazlar kadar etkili değildir.[9]
Lizozimin aktif bölgesi, peptidoglikan molekülünü iki alanı arasındaki belirgin yarığa bağlar. Doğal substratı olan (özellikle Gram-pozitif bakterilerin hücre duvarlarında bulunan) peptidoglikanlara, N-asetilmuramik asit (NAM) ile N-asetilglukozaminin (NAG) dördüncü karbon atomu arasında saldırır.[atıf gerekli]
Tetrasakkarit gibi daha kısa sakkaritlerin de uygun substratlar olduğu, ancak daha uzun zincirli bir ara ürün yoluyla gösterilmiştir.[10] Kitinin de uygun bir lizozim substratı olduğu gösterilmiştir. Yapay substratlar da geliştirilmiş ve lizozimde kullanılmıştır.[11]
Mekanizma
[düzenle]
Phillips
[düzenle]
Phillips mekanizması, enzimin katalitik gücünün hem bağlı substrat üzerindeki sterik gerilimden hem de bir okso-karbenyum ara ürününün elektrostatik stabilizasyonundan geldiğini öne sürmüştür. X-ışını kristalografik verilerinden Phillips, hekzasakkaritin bağlandığı enzimin aktif bölgesini önermiştir. Lizozim, hekzasakkaritteki dördüncü şekeri (D veya -1 alt bölgesinde) yarım koltuk konformasyonuna büker. Bu stresli durumda, glikozit bağı daha kolay kırılır.[12] Glikozit bağının kırılması sonucunda okso-karbenyum içeren iyonik bir ara ürün oluşur.[13] Böylece, substrat molekülünün geçiş durumuna benzer gergin bir konformasyon benimsemesine neden olan bozulma, reaksiyonun enerji bariyerini düşürecektir.[14]
Önerilen okso-karbonyum ara ürününün, 1978'de Arieh Warshel tarafından aktif bölgedeki aspartat ve glutamat kalıntıları tarafından elektrostatik olarak stabilize edildiği ileri sürülmüştür. Elektrostatik stabilizasyon argümanı, yığın suyla karşılaştırmaya dayanıyordu; su dipollerinin yeniden yönlendirilmesi, yük etkileşiminin dengeleyici enerjisini ortadan kaldırabilir. Warshel'in modelinde enzim bir süper çözücü görevi görür, iyon çiftlerinin yönelimini sabitler ve süper-solvasyon (iyon çiftlerinin çok iyi stabilizasyonu) sağlar ve özellikle iki iyon birbirine yakın olduğunda enerjiyi düşürür.[15]
Bu mekanizmadaki hız belirleyici adım (RDS), okso-karbenyum ara ürününün oluşumu ile ilgilidir. Tam RDS'yi gösteren bazı çelişkili sonuçlar vardı. Ürün oluşumunun (p-nitrofenol) izlenmesiyle, RDS'nin farklı sıcaklıklarda değişebileceği keşfedildi ve bu durum söz konusu çelişkili sonuçların bir nedeniydi. Daha yüksek bir sıcaklıkta RDS, glikozil enzim ara ürününün oluşumudur; daha düşük bir sıcaklıkta ise bu ara ürünün parçalanmasıdır.[16]
Kovalent mekanizma
[düzenle]
1969'daki erken bir tartışmada, Dahlquist kinetik izotop etkisine dayanarak lizozim için kovalent bir mekanizma önermiştir,[13] ancak uzun bir süre iyonik mekanizma daha kabul görmüştür. 2001 yılında, Vocadlo tarafından iyonik değil kovalent bir ara ürün aracılığıyla revize edilmiş bir mekanizma önerilmiştir. ESI-MS analizinden elde edilen kanıtlar kovalent bir ara ürüne işaret etmiştir. Reaksiyon hızını düşürmek ve karakterizasyon için bir ara ürün biriktirmek amacıyla 2-floro ikameli bir substrat kullanılmıştır.[18] Glutamik asit 35 (Glu35) ve aspartat 52 (Asp52) amino asit yan zincirlerinin bu enzimin aktivitesi için kritik olduğu bulunmuştur. Glu35, substrattaki C-O bağını kopararak glikozit bağına bir proton donörü görevi görürken, Asp52 bir glikozil enzim ara ürünü oluşturmak için nükleofil görevi görür. Glu35, sudan daha güçlü bir nükleofil olan hidroksil iyonunu oluşturmak için suyla reaksiyona girer; bu iyon daha sonra glikozil enzim ara ürününe saldırarak hidroliz ürününü verir ve enzimi değişmeden bırakır.[19] Enzim katalizi için bu tür bir kovalent mekanizma ilk olarak Koshland tarafından önerilmiştir.[20]
Daha yakın zamanlarda, kuantum mekaniği/ moleküler mekanik (QM/MM) moleküler dinamik simülasyonları HEWL kristalini kullanmış ve kovalent bir ara ürünün varlığını öngörmüştür.[21] ESI-MS ve X-ışını yapılarından elde edilen kanıtlar kovalent ara ürünün varlığını göstermektedir, ancak öncelikle daha az aktif bir mutant veya doğal olmayan bir substrat kullanımına dayanmaktadır. Bu nedenle, QM/MM moleküler dinamiği, vahşi tip HEWL ve doğal substratın mekanizmasını doğrudan araştırmak için benzersiz bir yetenek sağlar. Hesaplamalar, kovalent mekanizmadan elde edilen kovalent ara ürünün, Phillips mekanizmasından elde edilen iyonik ara üründen ~30 kcal/mol daha kararlı olduğunu ortaya koymuştur.[21] Bu hesaplamalar, iyonik ara ürünün enerjisel olarak son derece elverişsiz olduğunu ve daha az aktif mutant veya doğal olmayan substratlar kullanılarak yapılan deneylerde gözlemlenen kovalent ara ürünlerin, vahşi tip HEWL'nin mekanizması hakkında yararlı bilgiler sağladığını göstermektedir.[atıf gerekli]
İnhibisyon
[düzenle]
İmidazol türevleri, lizozimin rekabetçi inhibisyonunu sağlamak için bazı kalıntılarla (aktif merkez içinde veya dışında) bir yük transfer kompleksi oluşturabilir.[22] Gram-negatif bakterilerde lipopolisakkarit, lizozim ile yüksek derecede tercih edilen bir bağlanma yoluyla rekabetçi olmayan bir inhibitör görevi görür.[23]
Daha fazla bilgi: Glikozit hidrolaz
Enzimatik olmayan etki
[düzenle]
Lizozimin muramidaz aktivitesinin antibakteriyel özellikleri için kilit rol oynadığı varsayılmasına rağmen, enzimatik olmayan etkisine dair kanıtlar da bildirilmiştir. Örneğin, aktif bölgedeki kritik amino asidin (52-Asp -> 52-Ser) mutasyonu ile lizozimin katalitik aktivitesinin bloke edilmesi, antimikrobiyal aktivitesini ortadan kaldırmaz.[24] Lizozimin, litik aktivite olmaksızın bakteriyel karbonhidrat antijenini tanıma konusundaki lektin benzeri yeteneği, Klebsiella pneumoniae'nin lipopolisakkariti ile ilişkili tetrasakkarit için bildirilmiştir.[25] Ayrıca lizozim, antikorlar ve T-hücresi reseptörleri ile etkileşime girer.[26]
Enzim konformasyon değişiklikleri
[düzenle]
Lizozim iki konformasyon sergiler: açık aktif durum ve kapalı inaktif durum. Katalitik alaka, tek duvarlı karbon nanotüp (SWCN) alan etkili transistörler (FET'ler) ile incelenmiş, burada tekil bir lizozim SWCN FET'e bağlanmıştır.[27] Lizozimin elektronik olarak izlenmesi, iki konformasyonu, yani açık aktif bölgeyi ve kapalı inaktif bölgeyi göstermiştir. Aktif durumunda lizozim, substratını süreçsel olarak hidrolize edebilir ve saniyede 15 hızla ortalama 100 bağı kırabilir. Yeni bir substrat bağlamak ve kapalı inaktif durumdan açık aktif duruma geçmek için iki konformasyon adımı değişikliği gerekirken, inaktivasyon tek bir adım gerektirir.[atıf gerekli]
Üst aile
[düzenle]
Geleneksel C-tipi lizozim, lizozim üst ailesi olarak adlandırılan yapısal ve mekanistik olarak ilişkili daha büyük bir enzim grubunun parçasıdır. Bu aile, GH22 C-tipi ("tavuk") lizozimlerini bitki kitinazı GH19, G-tipi ("kaz") lizozim GH23, V-tipi ("viral") lizozim GH24 ve kitozanaz GH46 aileleriyle birleştirir. Lizozim tipi isimlendirmesi yalnızca bir tipin başlangıçta izole edildiği kaynağı yansıtır ve taksonomik dağılımı tam olarak yansıtmaz.[28] Örneğin, insanlar ve diğer birçok memeli, LYG1 ve LYG2 olmak üzere iki G-tipi lizozim genine sahiptir.[29]
Hastalık ve tedavideki rolü
[düzenle]
Lizozim, doğal bağışıklık sisteminin bir parçasıdır. Düşük lizozim seviyeleri, yenidoğanlarda bronkopulmoner displazi ile ilişkilendirilmiştir.[34] İnsan lizozimi içeren sütle beslenen domuz yavruları, E. coli kaynaklı ishalli hastalıktan daha hızlı iyileşebilir. İnsan sütündeki lizozim konsantrasyonu, çiftlik hayvanlarının sütündeki konsantrasyondan 1.600 ila 3.000 kat daha fazladır. İnsan lizozimi, tavuk yumurtası akı lizoziminden daha aktiftir. İnsan sütünün faydalarından yararlanamayan çocukları ishalden korumak için insan lizozimi içeren süt üretmek üzere (kurucusu "Artemis" adında bir keçi olan) transgenik bir keçi hattı geliştirilmiştir.[35][36]
Lizozim, Bacillus ve Streptococcus gibi Gram-pozitif patojenlere karşı doğal bir koruma şekli olduğundan,[37] insan sütüyle beslenmede bebeklerin immünolojisinde önemli bir rol oynar.[38] Cilt, kuruluğu ve asitliği nedeniyle koruyucu bir bariyerken, konjonktiva (gözü kaplayan zar) bunun yerine esas olarak lizozim ve defensin gibi salgılanan enzimler tarafından korunur. Ancak bu koruyucu bariyerler başarısız olduğunda konjonktivit oluşur.[atıf gerekli]
Bazı kanserlerde (özellikle miyelomonositik lösemi), kanser hücreleri tarafından aşırı lizozim üretimi, kanda toksik lizozim seviyelerine yol açabilir. Yüksek lizozim kan seviyeleri böbrek yetmezliğine ve düşük kan potasyumuna yol açabilir; bu durumlar birincil malignitenin tedavisiyle iyileşebilir veya çözülebilir.[atıf gerekli]
Serum lizozimi, sarkoidoz tanısı için serum anjiyotensin dönüştürücü enzime göre çok daha az spesifiktir; ancak daha hassas olduğu için sarkoidoz hastalık aktivitesinin bir belirteci olarak kullanılır ve kanıtlanmış vakalarda hastalık takibi için uygundur.[39]
Kimyasal sentez
[düzenle]
Bir lizozim proteininin ilk kimyasal sentezi, İngiltere'deki Liverpool Üniversitesi'nden Prof. George W. Kenner ve grubu tarafından denenmiştir.[40] Bu, nihayet 2007 yılında Chicago Üniversitesi'ndeki Steve Kent'in laboratuvarında sentetik fonksiyonel bir lizozim molekülü yapan Thomas Durek tarafından başarılmıştır.[41]
Diğer uygulamalar
[düzenle]
Lizozim kristalleri, kataliz ve biyomedikal uygulamalar için diğer fonksiyonel malzemeleri büyütmek için kullanılmıştır.[42][43][44] Lizozim, gram pozitif bakterileri parçalamak için yaygın olarak kullanılan bir enzimdir.[45] Hücre duvarını sindirme ve ozmotik şoka neden olma (hücre çevresindeki çözünen madde konsantrasyonunu ve dolayısıyla ozmotik basıncı aniden değiştirerek hücreyi patlatma) gibi benzersiz işlevi nedeniyle lizozim, laboratuvar ortamında bakterinin periplazmasından proteinleri serbest bırakmak için yaygın olarak kullanılırken, iç zar sferoplast adı verilen veziküller olarak kapalı kalır.[46][47]
Örneğin, E. coli, periplazmik boşluğun içeriğini boşaltmak için lizozim kullanılarak parçalanabilir. Özellikle periplazma içeriğini toplamaya çalışılan laboratuvar ortamında yararlıdır.[1] Lizozim tedavisi belirli sıcaklıklarda, pH aralıklarında ve tuz konsantrasyonlarında optimaldir. Lizozim aktivitesi, 6.0-7.0 pH aralığında 60 santigrat dereceye kadar artan sıcaklıklarla artar. Mevcut tuzlar da lizozim tedavisini etkiler; bazıları inhibitör etkiler gösterirken, diğerleri lizozim tedavisi yoluyla lizisi teşvik eder. Sodyum klorür lizisi indükler, ancak yüksek konsantrasyonlarda aktif bir lizis inhibitörüdür. Potasyum tuzlarının kullanımıyla da benzer gözlemler yapılmıştır. Bakteriyel suşlardaki farklılıklar nedeniyle küçük farklılıklar mevcuttur.[48] Rekombinant proteinlerin protein kristalizasyonu için ekstraksiyonunda lizozim kullanımının bir sonucu, kristalin lizozim birimleriyle kontamine olabilmesi ve fizyolojik olarak ilgisiz bir kombinasyon oluşturabilmesidir. Aslında bazı proteinler bu tür bir kontaminasyon olmadan kristalize olamaz.[49][50]
Dahası, lizozim toksik rekombinant proteinlerin ekspresyonunda bir araç görevi görebilir. BL21(DE3) suşlarında rekombinant proteinlerin ekspresyonu tipik olarak T7-RNA-polimeraz tarafından gerçekleştirilir. IPTG indüksiyonu yoluyla UV-5 baskılayıcısı inhibe edilir, bu da T7-RNA-polimerazın ve dolayısıyla ilgi duyulan proteinin transkripsiyonuna yol açar. Yine de, indüksiyon olmadan bile bazal bir T7-RNA-polimeraz seviyesi gözlemlenebilir. T7 lizozimi, T7-RNA-polimerazın bir inhibitörü görevi görür. Yardımcı bir plazmit (pLysS) içeren yeni icat edilen suşlar, düşük seviyelerde T7 lizozimini yapısal olarak birlikte eksprese ederek toksik rekombinant proteinin yüksek hassasiyetini ve tutarlı ekspresyonunu sağlar.[51]
Tarihçe
[düzenle]
Tavuk yumurtası akının, içerdiği lizozim nedeniyle sahip olduğu antibakteriyel özellik ilk olarak 1909'da Laschtschenko tarafından gözlemlenmiştir.[52] Burun mukusunun bakteri öldürücü aktivitesi, penisilini keşfeden Alexander Fleming tarafından 1922'de gösterilmiş ve "lizozim" terimini ortaya atmıştır.[53] Fleming'in şöyle dediği aktarılmaktadır: "Bu madde fermentlerinkine benzer özelliklere sahip olduğundan ona bir 'Lizozim' adını verdim."[54] Fleming, enzimatik bir maddenin çok çeşitli salgılarda bulunduğunu ve özellikle incelediği sarı bir "kokusu" olmak üzere farklı bakterileri hızla parçalayabildiğini (yani çözebildiğini) göstermeye devam etmiştir".[55]
Lizozim ilk olarak 1937'de Edward Abraham tarafından kristalize edilmiş, bu da tavuk yumurtası akı lizoziminin üç boyutlu yapısının, 1965'te X-ışını kristalografisi yoluyla ilk 2-angstrom (200 pm) çözünürlüklü modeli elde eden David Chilton Phillips tarafından tanımlanmasını sağlamıştır.[56][57] Yapı, 1965 yılında bir Royal Institution dersinde halka sunulmuştur.[58] Lizozim, X-ışını kırınımı yöntemleriyle çözülen ikinci protein yapısı ve ilk enzim yapısı olmuş ve yirmi yaygın amino asidin tamamını içeren, dizisi tamamen belirlenen ilk enzim olmuştur.[59] Phillips'in lizozim yapısını aydınlatmasının bir sonucu olarak, katalitik etki yöntemi için ayrıntılı, spesifik bir mekanizma önerilen ilk enzim olmuştur.[60][61][10] Bu çalışma, Phillips'in enzimlerin fiziksel yapıları açısından kimyasal bir reaksiyonu nasıl hızlandırdığına dair bir açıklama sunmasına yol açmıştır. Phillips tarafından önerilen orijinal mekanizma daha yakın zamanda revize edilmiştir.[18]
Ayrıca bakınız
[düzenle]
Yumurta alerjisi
Referanslar
[düzenle]